陳芳榮，龔護民，茹美艷，施蕾，盧敏

（海南省人民醫(yī)院婦產科，海南?？?570311）

子癇前期患者胎盤NF-κB的表達及其與細胞因子變化的相關性

陳芳榮，龔護民，茹美艷，施蕾，盧敏

（海南省人民醫(yī)院婦產科，海南?？?570311）

目的探討子癇前期患者胎盤NF-κB的表達及其與細胞因子的變化關系。方法選取在海南省人民醫(yī)院婦產科住院的晚孕產婦120例，其中正常妊娠組40例，子癇前期組80例（輕度40例，重度40例）。采用免疫組化法檢測胎盤NF-κB p65、VCAM-1、IκB-α和Bcl-1的表達。采用ELISA法檢測分娩前血清TNF-α、VCAM-1和IL-4水平。子癇前期組和正常妊娠組進行統(tǒng)計學分析，判斷結果有無統(tǒng)計學意義。結果子癇前期組較正常妊娠組的胎盤NF-κB p65、VCAM-1表達明顯升高；IκB-α、Bcl-1表達明顯降低（P＜0.01）；子癇前期患者血清細胞因子TNF-α、VCAM-1水平明顯高于正常妊娠組，IL-4水平明顯低于對照組（P＜0.01）。結論子癇前期患者胎盤NF-κB活化增強與細胞因子表達密切相關，其參與免疫炎癥反應及胎盤細胞損傷，加速子癇前期的發(fā)病過程。

子癇前期；NF-κB；細胞因子；炎癥

子癇前期是妊娠期特有的疾病，是屬于妊娠期高血壓疾病的一種。子癇前期發(fā)病率在我國產婦中達9.4%～10.4%[1]，是導致孕產婦及新生兒死亡的主要原因之一。子癇前期的發(fā)病原因很多，可能與免疫機制、胎盤淺著床、血管內皮受損、遺傳因素營養(yǎng)缺乏等有關，但至今臨床均不能闡明其發(fā)病原因及發(fā)病機制。

迄今為止，臨床上仍無有效的方法預防子癇前期。由于眾多炎癥介質構成復雜網絡及炎癥介質過度釋放形成瀑布效應，拮抗單一炎癥介質顯得力不從心，只有采用干涉信號傳導通路的“瓶頸”才可能從根本解決難題。核轉錄因子-κB(NF-κB)便是控制炎性因子基因表達的重要瓶頸之一，拮抗NF-κB活化，起到事半功倍的抗炎效果。大量實驗證明NF-κB在炎癥性疾病中起關鍵作用。本項目從母胎界面免疫、炎癥、細胞因子的角度入手，檢測子癇前期中胎盤NF-κB表達與細胞因子的變化關系，旨在探討胎盤核轉錄因子-κB(NF-κB p65)、血管內皮細胞粘附分子-1(VCAM-1)、抑制性亞單位(IκB-α)、抗凋亡蛋白(Bcl-1)與血清細胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管內皮細胞粘附分子-1(VCAM-1)、白細胞介素-4 (IL-4)的相關性及其與子癇前期發(fā)生發(fā)展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料隨機選取2009年1月至2012年1月在海南省人民醫(yī)院住院的晚孕患者120例，其中正常妊娠組40例，子癇前期患者80例(輕度40例，重度40例)。按2008年4月第七版婦產科制定的標準[2]進行診斷子癇前期，未臨產、無妊娠并發(fā)癥、無高血壓史、腎病史及糖尿病史等其他合并癥。對照組年齡(25.3±2.4)歲，孕周(35.3±4.6)周。輕度子癇前期組年齡(26.4±2.6)歲，孕周(33.2±5.2)周。重度子癇前期組年齡(26.8±3.2)歲，孕周(32.5±5.3)周。子癇前期組(輕、重)與正常妊娠組的年齡差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 標本采集及處理流程圖詢問病史，查體，查血尿常規(guī)、肝腎功能、凝血四項、心電圖、心臟彩超等，確認符合入組標準：分正常妊娠組和子癇前期(輕、重)組。檢測胎盤形態(tài)學、NF-κB表達及細胞因子水平。

1.3 各項觀察指標及其檢測方法

1.3.1 胎盤NF-κB p65、VCAM-1、IκB-α、Bcl-1的檢測剖宮產時胎兒娩出后無菌操作下取兩組研究對象胎盤組織，立即從胎盤母體面取胎盤組織塊(避開鈣化壞死區(qū))，大小約1 cm×1 cm×1 cm。立即以10%福爾馬林固定6～12 h后給予石蠟包埋，繼而連續(xù)切片。以蘇木素伊紅(HE)染色復診。再以免疫組化(通用二步法)檢測胎盤NF-κB p65、VCAM-1、IκB-α、Bcl-1。觀察結果采用雙盲法。胎盤NF-κB p65、VCAM-1、IκB-α、Bcl-1的表達以光鏡下在細胞胞漿出現的棕黃色顆粒為標準，無染色或與非特異性染色者一致的為染色陰性，其著色強度高于背景者判定為陽性。根據陽性細胞百分率及染色深淺確定NF-κB p65、VCAM-1、IκB-α、Bcl-1的表達水平。陽性細胞百分率分為：無細胞顯色為-；小于25%細胞顯色為+；25%～50%細胞顯色為++；大于50%細胞顯色為+++。

1.3.2 血清細胞因子TNF-α、VCAM-1、IL-4的檢測收集兩組患者血清4m l，離心10m in取上清液，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測TNF-α、VCAM-1、IL-4水平。以吸光度A值為Y軸，相應的TNF-α、VCAM-1、IL-4標準品濃度為X軸做標準曲線。樣品的TNF-α、VCAM-1、IL-4含量可根據其ID值由標準曲線推斷出來。

1.4 統(tǒng)計學方法使用SAS9.0統(tǒng)計分析系統(tǒng)進行數據處理。計量資料以均數±標準差(x-±s)表示，兩組間的均數比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

HE染色顯示，子癇前期患者胎盤局灶廣泛梗死，絨毛纖維素樣壞死，合體滋養(yǎng)細胞結節(jié)樣增生，血管壁增厚等病理變化明顯多于正常妊娠者(見圖1)。

圖1 胎盤HE的染色（蘇木素-伊紅，×50）

2.1 各組胎盤NF-κB p65、VCAM-1、IκB-α、Bcl-1表達比較子癇前期組較正常妊娠組胎盤NF-κB p65、VCAM-1的表達明顯升高，且隨著病情加重明顯增加(圖2、圖3)；子癇前期組較正常妊娠組胎盤IκB-α、Bcl-1表達明顯降低，且隨著病情加重明顯降低(圖4、圖5)。

圖2 胎盤NF-κB p65的表達(通用二步法，DAB染色，蘇木素復染，×50)

圖3 胎盤VCAM-1的表達(通用二步法，DAB染色，蘇木素復染，×50)

圖4 胎盤IκB-α的表達(通用二步法，DAB染色，蘇木素復染，×50)

圖5 胎盤Bcl-1的表達(通用二步法，DAB染色，蘇木素復染，×50)

2.2 各組患者血清細胞因子TNF-α、VCAM-1、IL-4水平比較子癇前期組患者血清TNF-α、VCAM-1水平明顯高于正常妊娠組，且隨著病情加重明顯升高。子癇前期組患者的血清IL-4水平明顯低于正常妊娠組，且隨著病情加重明顯降低，見表1。

表1 對照組與子癇前期患者血清TNF-α、VCAM-1、IL-4水平變化(±s)

表1 對照組與子癇前期患者血清TNF-α、VCAM-1、IL-4水平變化(±s)

注：輕度子癇前期組、重度子癇前期組與對照組比較，aP＜0.01。

組別對照組輕度子癇前期組重度子癇前期組例數40 40 40 TNF-α(ng/m l) 14.27±1.34 26.53±1.58a51.5±3.23aVCAM-1(μg/ml) 85.14±6.23 119.35±9.80a128.1±13.11aIL-4(μg/ml) 27.01±1.97 13.16±1.52a7.01±1.14a

3 討論

3.1 子癇前期與免疫、炎癥胎盤是母胎界面維持胎兒在宮內營養(yǎng)和生長發(fā)育的重要器官。母胎界面免疫細胞包括巨噬細胞、T細胞、NK細胞及蛻膜顆粒細胞等，巨噬細胞在母胎界面非特異性免疫中發(fā)揮一定的作用。巨噬細胞被激活后可以分泌TNF-α來限制滋養(yǎng)細胞的浸潤能力[3]。子癇前期孕婦胎盤巨噬細胞可誘導滋養(yǎng)細胞凋亡增加，滋養(yǎng)細胞侵入子宮胎盤的螺旋動脈減少，滋養(yǎng)細胞的浸潤能力下降可能是子癇前期患者發(fā)病的主要原因[4]。IL-1、IL-2、TNF由Th1細胞分泌，表現為免疫侵害；IL-4、IL-10由Th2細胞分泌，表現為免疫防護反應。正常妊娠孕婦中Th2免疫增強，子癇前期孕婦則表現為Th1型占優(yōu)勢。先兆子癇患者中NK細胞、巨噬細胞表達明顯提高。巨噬細胞凋亡增加，能使免疫反應減弱。一般情況下，母胎界面蛻膜細胞可減少NK細胞對胎兒的免疫損傷，子癇前期患者滋養(yǎng)細胞侵蝕能力下降，導致蛻膜細胞抑制NK細胞的作用減弱。粘附分子參與滋養(yǎng)細胞形成及分化。滋養(yǎng)細胞侵蝕能力下降，還可能與粘附分子表達障礙有一定關系，隨著子癇前期孕婦收縮壓升高，血中VCAM-1表達升高，滋養(yǎng)細胞侵蝕能力明顯下降[5]。VCAM-1還可使白細胞通過內皮細胞間的連接處進入組織，引起炎性反應，并吸引更多的白細胞到內皮細胞表面，進一步促進白細胞活化與粘附，造成惡性循環(huán)[6]。而血管內皮VCAM-1的異常表達可反映內皮細胞的損傷。

3.2 NF-κB與免疫、炎癥NF-κB是一種廣泛存在于細胞中的蛋白質因子，其具有多向性轉錄調節(jié)作用。典型的NF-κB是由p50和p65亞基形成的異二聚體。在NF-κB家族中p65亞單位是主要的促炎亞單位[7]。目前發(fā)現能激活NF-κB的因素至少150種，大約有200多種基因受NF-κB調控。TNF-α、IL-1和NF-κB相互制約，相互影響，兩者為正相關。TNF-α、IL-1既是NF-κB的激動劑，又是其靶基因。NF-κB被活化后可誘導IκB表達，IκB進入胞核后NF-κB從DNA上解離，轉移到胞質，這樣形成負反饋調節(jié)[8]。TNF-α是炎癥反應的重要啟動因子，通過花生四烯酸代謝途徑、蛋白激酶途徑、氧自由基、一氧化氮(NO)、各種細胞毒性基因轉錄及核因子調控、ADP核糖基化、DNA片段等多種途徑造成心肌損傷[9]。NF-κB的活化與機體的免疫密切相關，NF-κB參與樹突狀細胞的抗原遞呈和T細胞的活化。樹突狀細胞過度表達IκBα后可抑制NF-κB的活性，引起IL-12、TNF-α的表達下降，而導致免疫耐受。NF-κB是炎癥因子基因表達的重要因子之一，被稱為前炎癥介質轉錄因子。NF-κB被各種損傷因素激活后可誘導炎癥相關因子的基因轉錄，其中包括細胞因子(IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IFN-β、TNF-α)、粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、趨化因子(IL-8、補體C3)、轉錄因子(IκBα、p150、c-Rel、Bcl-3)等。本研究結果發(fā)現，子癇前期組較正常妊娠組的胎盤NF-κB p65、VCAM-1表達明顯升高，且隨著病情加重明顯增加；子癇前期組較正常妊娠組的胎盤IκB-α、Bc-1表達明顯降低，且隨著病情加重明顯降低。

3.3 NF-κB與細胞因子NF-κB與胚胎的植入相關。雌激素在轉錄水平通過誘導IκBα及降低NF-κB活性來抑制CD4+T細胞中IL-2的產生[10]。NF-κB P65活化降低，TNF-α、INF-γ、巨噬細胞炎癥因子減少，NF-κB在妊娠期免疫反應中起重要作用[11]。VCAM-1還可使白細胞通過內皮細胞間的連接處進入組織，引起炎性反應，并吸引更多的白細胞到內皮細胞表面，進一步促進白細胞活化與粘附，造成惡性循環(huán)[12]。而血管內皮VCAM-1的異常表達可反映內皮細胞的損傷。

NF-κB是ICAM-1的上游基因調控蛋白，它通過細胞間信號轉導粘附分子的轉錄活性，早期即在轉錄水平調控內皮源性基因ICAM-1的表達[13]。NF-κB是一種廣泛存在于細胞中具有多向性轉錄調節(jié)作用的蛋白質因子，它能與多種細胞因子、粘附分子基因啟動子部位的位點發(fā)生結合，增強這些基因的轉錄和表達，導致TNF、IL-1、IL-6、IL-8、ICAM-1和P-selectin等基因過度表達，是炎癥反應的核心，抑制NF-κB的活性可減少IL-6、TNF-α的產生[14]。

子癇前期滋養(yǎng)細胞的凋亡、NF-κB活性的增加、抗凋亡蛋白bcl-1的減少這三者之間密切相關。比較子癇前期孕婦血漿和正常孕婦血漿培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞，已發(fā)現子癇前期孕婦血漿中過氧化物表達是正常孕婦的4.5倍，子癇前期患者的血漿可使內皮細胞的NF-κB表達提高2.5倍并使細胞表面ICAM-1表達上升，證實了子癇前期孕婦血漿中的過氧化物可能通過活化NF-κB來提高ICAM-1表達，從而導致內皮細胞功能紊亂[15]。子癇前期患者血漿中過氧亞硝酸鹽升高后，通過NF-κB誘導血管內皮細胞iNOS表達升高，說明其與內皮細胞損傷呈正相關[10]。TNF-α的水平還與子癇前期發(fā)生發(fā)展程度有一定相關性，先兆子癇發(fā)生時血清TNF-α水平會急劇升高[16-17]。本組資料結果表明，子癇前期組患者血清TNF-α、VCAM-1水平明顯高于正常妊娠組，且隨著病情加重明顯升高。子癇前期組患者血清IL-4水平明顯低于正常妊娠組，且隨著病情加重明顯降低。

綜上所述，子癇前期組患者胎盤NF-κB p65、VCAM-1表達與病情加重呈正相關，而IκB-α、Bcl-1的表達則與病情加重呈負相關(P＜0.01)。子癇前期組患者血清細胞因子TNF-α、VCAM-1水平與患者病情加重呈正相關，而IL-4水平則與病情加重呈負相關(P＜0.01)。提示子癇前期患者胎盤NF-κB呈現活化增強，與細胞因子表達密切相關，其參與免疫炎癥反應及胎盤細胞損傷，加速子癇前期的發(fā)病過程。

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Expression of NF-κBin placenta of preeclampsia and its relationship with changes of cytokines.

CHEN Fang-rong,GONG Hu-ming,RU Mei-yan,SHI Lei,LU Min.Department of Gynaecology and Obstetrics,People's HospitalofHainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of nuclear factor-kappa B(NF-κB)in placenta of preeclampsia and its relationship w ith the changes of cytokines.MethodsOne hundred and twenty late pregnant patients in Departmentof Gynaecology and Obstetrics in People's Hospital of Hainan Provincewere recruited:40 normal pregnant women(the control group)and 80 preeclampsia patients(the preeclampsia group,40 with m ild preeclampsia and 40w ith severe preeclampsia).Expression of placenta NF-κB p65,VCAM-1,IκB-αand Bcl-1were determined by immunofluorescence.Serum TNF-α,VCAM-1 and IL-4 levels before delivery were detected by ELISA. The preeclampsia group and the controlgroup were analyzed statistically to determinewhether theResultswere statisti-cally significant.ResultsComparedwith the controlgroup,the levelsof placenta NF-κB p65,VCAM-1 in preeclampsia groupwere significantly elevated,while the levelsof IκB-αand Bcl-1 in preeclampsiagroup were significantly decreased(P＜0.05).The levels of serum TNF-α,VCAM-1 in preeclampsiagroup were significantly higher than those in the control group(P＜0.05),while the level of serum IL-4 wassignificantly decreased(P＜0.05).ConclusionThe placenta NF-κB of preeclam psia is activated and enhanced,closely related w ith the expression of cytokines,w hich involved in the immune inflammatory reaction and placental cell injury,and accelerates the pathogenesisof preeclampsia.

Preeclampsia;Nuclear factor-kappa B(NF-κB);Cytokines;Inflammatory

R714.24+5

A

1003—6350（2014）04—0483—04

2013-09-02)

海南省自然科學基金資助項目（編號：30636）

龔護民。E-mail：13337610058@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.04.0187