壽林飛，楊 挺，徐 堅，朱 勇，趙 健，章 豪，吳銀良?

（1.浙江省農(nóng)藥檢定管理所，浙江杭州 310020；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040；3.仙居縣農(nóng)產(chǎn)品檢測中心，浙江仙居 317300）

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定水果中5種苯并咪唑類殺菌劑

壽林飛1，楊 挺2，徐 堅3，朱 勇2，趙 健2，章 豪2，吳銀良2?

（1.浙江省農(nóng)藥檢定管理所，浙江杭州 310020；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040；3.仙居縣農(nóng)產(chǎn)品檢測中心，浙江仙居 317300）

試驗建立了草莓、葡萄和蘋果中5種苯并咪唑類殺菌劑（多菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈、硫菌靈和苯菌靈）的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品用乙腈提取和無水硫酸鎂鹽析后，上清液直接用0.1%甲酸溶液稀釋40倍后進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，外標法定量。各峰面積與樣品濃度在2×10－5～0.075mg·L－1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸系數(shù)＞0.999。添加濃度0.01～5.0mg·kg－1，5種殺菌劑的平均添加回收率75.0%～95.0%，變異系數(shù)2.0%～5.0%。多菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈、硫菌靈和苯菌靈在實際樣品的定量限分別為0.005，0.002，0.01，0.01和0.005mg·kg－1。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；苯并咪唑類殺菌劑；水果

苯并咪唑類（benzimidazoles）殺菌劑是以有殺菌活性的苯并咪唑環(huán)為母體的一類有機殺菌劑。在農(nóng)業(yè)上可防治麥類黑穗病、赤霉病、水稻稻瘟病、紋枯病、瓜類白粉病、炭疽病、灰霉病和花卉病害等多種真菌病害，效果顯著。代表性的苯并咪唑類殺菌劑有苯菌靈、多菌靈、硫菌靈、甲基硫菌靈以及噻菌靈等。目前該類藥物在生產(chǎn)上仍廣泛使用，但由于苯并咪唑殺菌劑在試驗動物和靶動物中顯示致畸和致突變作用，且在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物亦有毒理作用［1］，是食品殘留的監(jiān)控對象。

目前對于蔬菜和水果中苯并咪唑類殺菌劑的分析方法較多，其中應(yīng)用最多的是液相色譜法（LC）［2－8］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS／MS）［9－11］。由于液液分配、固相萃取等樣品凈化方式費時、費試劑、步驟較多、再加上甲基硫菌靈易降解，不適合測定苯并咪唑類殺菌劑殘留。為縮短前處理時間和減少前處理步驟，牟仁祥等［2］利用乙二胺基-N-丙基（primarysecondaryamine，PSA）凈化樣品提取液建立了快速的分散固相萃取凈化方法，凈化后的樣品提取液經(jīng)稀釋后直接進行LC分析。由于水果中苯并咪唑類殺菌劑限量（0.1～ 10mg·kg－1）較高以及LC-MS／MS對苯并咪唑類殺菌劑分析的高靈敏性和選擇性，本研究嘗試建立樣品經(jīng)乙腈提取后直接稀釋進行分析的LC-MS／MS方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

WatersAcquityUPLCXevoTMTQMS液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司），配置電噴霧離子源；Sigma3k15型離心機（德國）；Ultra-TyrraxT25型勻質(zhì)器（德國）。苯菌靈、多菌靈、硫菌靈、甲基硫菌靈和噻菌靈標準品（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈和甲醇均為色譜純（Fisher公司）；甲酸為色譜純（阿拉丁試劑（上海）有限公司）；蘋果、草莓和葡萄均為市售。

1.2 儀器條件

AcquityBHEC18色譜柱（100mm×2.1mm，內(nèi)徑1.7μm）；流動相A為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈。

梯度洗脫條件：B相在0.5min內(nèi)保持15%，然后在2.5min內(nèi)線性增至90%，保持1.0min；在0.1min內(nèi)降至15%，保持0.9min；流速0.3 mL·min－1，進樣量10μL，柱溫30℃。

質(zhì)譜條件。ESI源正離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），毛細管電壓1.0kV，萃取錐孔電壓20V，RF透鏡電壓0.5V，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度500℃，錐孔氣流速50L·h－1，脫溶劑氣流速1000L·h－1，倍增器電壓650V，二級碰撞氣為氬氣，其他條件詳見表1。

表1 苯并咪唑類殺菌劑的定性、定量離子對、錐孔電壓及碰撞能量

1.3 樣品處理

母乳中含有嬰兒生長發(fā)育所需的營養(yǎng)成分及抗體,是嬰兒最好的食品。同時,母乳喂養(yǎng)也能促進子宮收縮,減少產(chǎn)后并發(fā)癥發(fā)生,加速惡露排出,不僅利于產(chǎn)婦產(chǎn)后康復(fù),也利于親子情感[1]。但是受多種因素影響,我國目前母乳喂養(yǎng)率低于世界水平,尤其是剖宮產(chǎn)術(shù)后。剖宮產(chǎn)所致手術(shù)創(chuàng)傷會導(dǎo)致產(chǎn)婦產(chǎn)生身體應(yīng)激反應(yīng),術(shù)后可能出現(xiàn)體位不適、傷口疼痛、睡眠不足等,無法做到按需哺乳。泌乳不足及乳房脹痛是導(dǎo)致無法母乳喂養(yǎng)的主要原因。針對母乳喂養(yǎng)中存在的問題,本研究將射頻電療用于剖宮產(chǎn)術(shù)后護理中,現(xiàn)報道如下。

1.3.1 樣品處理

準確稱取10g水果樣品于帶蓋的聚四氟乙烯離心管中，加入20mL乙腈，高速勻漿1min后加5g無水硫酸鎂，劇烈振搖1min，以5000r· min－1離心3min，吸取上層有機溶劑50μL，與0.25mL乙腈和1.7mL0.1%甲酸溶液混合均勻，過0.22μm濾膜后進行LC-MS／MS分析。

1.3.2 線性試驗

分別稱取10mg苯菌靈、多菌靈、硫菌靈、甲基硫菌靈和噻菌靈等5種標準物質(zhì)于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度配置成1000μg· mL－1的儲備液。吸取標準儲備液各1mL于100mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋定容得到10μg·mL－1混合標準工作液，將混合標準工作液用0.1%甲酸溶液稀釋成2×10－5，2×10－4，5×10－4，0.002，0.005，0.02和0.075mg·L－1的標準溶液進行LCMS／MS分析，每濃度進樣3次，以標準工作液濃度為橫坐標，各物質(zhì)的定量離子對峰面積為縱坐標，繪制各物質(zhì)標準曲線。

1.3.3 基質(zhì)標準溶液線性試驗

樣品經(jīng)1.3.1進行提取后，分別吸取12.5，25，50，100和200μL上清液與20μL乙腈配制的系列標準工作液（0.002，0.02，0.05，0.2，0.5，2.0和7.5mg·L－1）、適量乙腈和0.1%甲酸溶液混合均勻，使除吸取200μL上清液配制的溶液外，其余2mL最終溶液中乙腈／水為85／15（V／V），混合溶液過0.22μm濾膜后進行LC-MS／MS分析。以各基質(zhì)標準工作液濃度為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標，繪制各物質(zhì)基質(zhì)標準曲線。

1.3.4 添加回收率試驗

本研究進行水果樣品的添加回收率試驗，樣品處理同1.3，樣品中5種苯并咪唑類藥物的添加濃度分別為0.01，0.05，0.5和5.0mg·kg－1。

2 結(jié)果與分析

苯并咪唑類殺菌劑色譜分析時，通常采用反相分離體系，主要有3類流動相體系：離子增強體系，pH值為2～3，一般使用乙腈-磷酸或磷酸鹽體系；離子抑制流動相體系，pH值為5～7；離子對流動相體系，離子增強流動相中加入陰離子對試劑。對多組分苯并咪唑類殺菌劑液相色譜質(zhì)譜分析時，通常采用離子增強體系進行梯度洗脫，如0.1%甲酸溶液-乙腈體系，因為該體系和純水-乙腈體系相比色譜峰的拖尾現(xiàn)象得到明顯改善。

苯并咪唑類殺菌劑屬弱堿性物質(zhì)，在酸性條件下極易質(zhì)子化。利用Intellistart軟件對5種苯并咪唑類殺菌劑在ESI＋模式下進行參數(shù)選擇和優(yōu)化，得到定性定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量。同時為提高分析靈敏度，時間窗口分為2段，分析時進行分段掃描。由圖1可知，5種殺菌劑藥物的峰形均較好，未見有明顯的干擾峰。

2.2 前處理方法的建立

牟仁祥等［2］研究表明，蔬菜和水果樣品用乙腈提取后，采用硫酸鎂進行鹽析，多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈的回收率均較好。進一步試驗表明，在此條件下，包括硫菌靈和苯菌靈在內(nèi)的5種苯并咪唑類殺菌劑的提取回收率均超過90%。因此本研究首先采用乙腈對樣品中的苯并咪唑類殺菌劑進行提取，再用硫酸鎂進行鹽析，然后對鹽析后的提取液采用不同稀釋配比進行基質(zhì)效應(yīng)研究。

從圖2可知，蘋果樣品提取液中5種苯并咪唑類殺菌劑經(jīng)20倍稀釋后基質(zhì)效應(yīng)較小（基質(zhì)標準曲線斜率和標準曲線斜率之比0.9～1.1），草莓和葡萄樣品提取液經(jīng)40倍稀釋后基質(zhì)效應(yīng)較小，本研究最終樣品均采用40倍稀釋進行試驗。

圖1 5種苯并咪唑類殺菌劑標準溶液（a1－a2，濃度為2×10－5mg·L－1）、葡萄空白樣品（b1－b2）、添加樣品（c1－c2，添加濃度為0.01mg·kg－1）MRM色譜圖

2.3 線性試驗

根據(jù)1.3.2線性試驗結(jié)果，對5種苯并咪唑類殺菌劑2×10－5～0.075mg·L－1濃度以峰面積對濃度作圖，所得標準曲線方程為Y＝4.21×107X－152.61（噻菌靈），Y＝1.96×107X＋318.59（多菌靈），Y＝8.36×106X＋160.95（苯菌靈），Y＝5.56×106X＋143.44（硫菌靈）和Y＝2.13×106X＋69.61（甲基硫菌靈），相關(guān)系數(shù)（R2）均高于0.999，說明本方法適用于5種苯并咪唑類殺菌劑的定量分析。

2.4 方法的檢出限、回收率和精密度

按照試驗測定步驟，在3種水果空白樣品中添加苯并咪唑混合標準溶液，每濃度添加3個樣品，按1.3進行樣品處理，測定加標回收率，考查方法的準確性和可靠性。

由表2可知，添加濃度0.01～5.0mg·kg－1時，5種農(nóng)藥的加標回收率78.5%～94.2%，變異系數(shù)2.7%～4.7%，能滿足殘留分析要求。其余2種水果中，5種農(nóng)藥的加標回收率在75.0%～93.8%，變異系數(shù)在2.2%～4.9%。同時按定性離子對信噪比3∶1計算，該方法對5種苯并咪唑類殺菌劑的檢出限為6.0×10－4～0.003mg·kg－1；按定性離子對信噪比10∶1計算，該方法對苯菌靈、多菌靈、硫菌靈、甲基硫菌靈和噻菌靈的定量限分別為0.005，0.005，0.01，0.01和0.002mg· kg－1。我國GB2763—2012規(guī)定了水果中苯菌靈、多菌靈、甲基硫菌靈和噻菌靈的最高殘留限量分別在3～5，0.1～5，2～3和5～10mg·kg－1，而本法的定量限僅0.002～0.01mg·kg－1，可見本法完全能滿足實際樣品測定的需要。

2.5 方法應(yīng)用

2013年利用該法對寧波市87個葡萄樣品中的5種苯并咪唑類殺菌劑進行殘留量測定，結(jié)果表明，25個樣品中檢出多菌靈，含量在0.011～0.39mg·kg－1，3個樣品有噻菌靈殘留，濃度為0.030～0.079mg· kg－1，其余3種苯并咪唑類殺菌劑未檢出。

圖2 不同樣品提取液經(jīng)不同倍數(shù)稀釋后基質(zhì)標準曲線斜率與標準曲線斜率的比值

表2 葡萄中苯并咪唑類殺菌劑在不同添加濃度的平均回收率和變異系數(shù)

3 小結(jié)

試驗建立了快速測定水果中苯并咪唑類藥物的多殘留LC-MS／MS分析方法。對勻質(zhì)后的樣品用乙腈提取，再采用硫酸鎂鹽析，經(jīng)鹽析后的提取液直接稀釋后進行LC-MS／MS分析。對上述5種殺菌劑，本方法回收率在75.0%～95.0%，變異系數(shù)在2.0%～5.0%，方法檢出限在6.0×10－4～0.003mg·kg－1，定量限在0.002～0.010mg· kg－1。LC-MS／MS分析方法具有快速、靈敏和準確的特點，能夠滿足現(xiàn)行農(nóng)產(chǎn)品中苯并咪唑類殺菌劑的分析要求。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

TS255

B

0528-9017（2014）08-1240-04

文獻著錄格式：壽林飛，楊挺，徐堅，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定水果中5種苯并咪唑類殺菌劑［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（8）：1240－1243.

2014-06-14

寧波市農(nóng)科教結(jié)合項目（2013NK33）；2014年國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估項目

壽林飛（1979－），男，浙江諸暨人，農(nóng)藝師，碩士，主要從事農(nóng)藥殘留檢測與研究工作。E-mail：lfshou＠163.com。

吳銀良（1975－），男，教授級高工，從事農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留分析研究工作。E-mail：wupaddyfield＠sina.com。