馮 龍，郭文濤，路武豪，孫薩迦，董子明

（1.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450008；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450001；3.漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南漯河462002；4.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州450052）

食管癌細(xì)胞Fca9706 DNA聚合酶β基因敲除載體的構(gòu)建

馮 龍1，2，郭文濤3，路武豪4，孫薩迦2，董子明2

（1.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450008；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450001；3.漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南漯河462002；4.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州450052）

目的構(gòu)建食管癌細(xì)胞Fca9706 DNA聚合酶β（DNA polβ）基因敲除載體，為DNA polβ基因敲除奠定基礎(chǔ)。方法應(yīng)用體細(xì)胞基因敲除技術(shù)的方法和原理，根據(jù)DNA polβ基因序列，設(shè)計(jì)并合成2對(duì)特異性引物（UP1/UP2和DOWN1/DOWN2），通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得上游同源序列（UP）和下游同源序列（DOWN），其中上游同源序列長(zhǎng)1 268 bp，下游同源序列長(zhǎng)2 150 bp，將其插入骨架載體pcDNA3.1，從而構(gòu)建了DNA polβ基因敲除載體pOUT-polβ，最后用PCR、酶切和測(cè)序進(jìn)行鑒定。結(jié)果經(jīng)過(guò)PCR篩選，限制性酶切及DNA測(cè)序鑒定，證實(shí)上游同源序列（UP）和下游同源序列（DOWN）2個(gè)片段插入正確。結(jié)論通過(guò)本研究所述方法，成功構(gòu)建了用于食管癌細(xì)胞Fca9706 DNA polβ基因敲除載體pOUT-polβ。

基因敲除；DNA聚合酶；打靶載體；Fca9706細(xì)胞

DNA聚合酶β（DNA polymerase β，DNA polβ）是真核細(xì)胞DNA聚合酶家族的一員，為一看家基因，基因全長(zhǎng)35 000 bp，位于第8號(hào)染色體近著絲點(diǎn)處，是單拷貝基因，為斷裂基因，有14個(gè)外顯子及13個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄1 400 bp mRNA，其啟動(dòng)子位于主要轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游115 bp內(nèi)［1］。從酵母到哺乳類(lèi)細(xì)胞的polβ均高度保守，并且廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)，其表達(dá)產(chǎn)物是相對(duì)分子質(zhì)量為39 000的單鏈小分子蛋白，是真核細(xì)胞中相對(duì)分子質(zhì)量最小的DNA聚合酶。其主要功能是參與DNA損傷修復(fù)，尤其是堿基切除修復(fù)（base-excision repair，BFR），包括短片段BFR和長(zhǎng)片段BFR［2］。

自從重組全DNA技術(shù)克隆出了DNA polβ的cDNA以后，其生物學(xué)功能越來(lái)越受到人們的關(guān)注。近年來(lái)許多學(xué)者對(duì)DNA polβ在腫瘤組織及細(xì)胞系中的突變及表達(dá)狀態(tài)等進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為揭示腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，提供了一個(gè)新的切入點(diǎn)。目前已經(jīng)在結(jié)腸癌、食管癌、乳腺癌［3］、胃癌［4］、膀胱癌［5］、前列腺癌［6-7］等多種人類(lèi)腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了DNA polβ的基因突變和（或）表達(dá)異常［8-13］。

基因敲除是在20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其利用了基因轉(zhuǎn)移和重組的方法，將外源DNA導(dǎo)入打靶細(xì)胞中，然后將外源DNA的序列與打靶細(xì)胞染色體上同源的DNA序列進(jìn)行重組，從而能夠精細(xì)定點(diǎn)修飾以及改造目的基因片段。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因打靶也在不斷完善，并且，在干細(xì)胞基因敲除技術(shù)的基礎(chǔ)之上發(fā)展了體細(xì)胞基因敲除技術(shù)［14-15］，這是一種新型的研究特定人體基因生理學(xué)功能的高效、快速、特異的方法。相比之下，這種體細(xì)胞基因敲除技術(shù)操作過(guò)程更方便，更省時(shí)。自90年代起國(guó)外已有較多運(yùn)用體細(xì)胞基因敲除技術(shù)研究基因結(jié)構(gòu)功能的報(bào)道，但是國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［16-20］。本研究試圖運(yùn)用體細(xì)胞基因敲除的方法，設(shè)計(jì)并構(gòu)建人DNA polβ基因敲除載體，并用此載體轉(zhuǎn)染Fca9706細(xì)胞，通過(guò)進(jìn)一步的篩選，建立Fca9706細(xì)胞DNA polβ體細(xì)胞基因敲除模型，為下一步研究DNA polβ的生物學(xué)功能打下牢固的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料限制性核酸內(nèi)切酶 BglⅡ、HindⅢ、XhoⅠ、ApaⅠ購(gòu)自日本Takara公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司；pGFM-T-easy克隆載體購(gòu)自美國(guó)Promega公司；基因組DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自德國(guó)QIAGFN公司。食管癌細(xì)胞系 Fca9706、大腸桿菌DH5α、克隆載體pcDNA3.1均由本實(shí)驗(yàn)室保存。PCR引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司合成。下游同源序列擴(kuò)增用引物：ND1/ND2為外輪擴(kuò)增引物，ND3/ND4為內(nèi)輪擴(kuò)增引物，ND1 5’-GCCCTGTTCTCTGTAATTTCCACG-3’；ND2 5’-GACCTCAAGCAATTCAGACCCAAGC-3’；ND3 5’-GACAGATCTCCACGAAGCCTTGTGTACTGTGTCAC-3’Bgl II；ND4 5’-AACAAGCTTCCAGAAATGGGCTAGATAGCAACTC-3’HindⅢ。上游同源序列擴(kuò)增引物：UP1 5’-ACTCGAGGAGAGTGGTCACTGCTCACTG-3’XhoⅠ；UP2 5’-TGGGCCCGCTTGTTGTGACGTCACGCGTC-3’ApaⅠ。pGFM-T Fasy質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)兩側(cè)T7、SP6啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)通用引物：T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’；SP6 5’-CATACGTATTTAGGTGACACTATAG-3’。

1.2 人食管癌Eca9706細(xì)胞基因組提取與純化首先富集擴(kuò)增培養(yǎng)Fca9706細(xì)胞，3～4周后收集細(xì)胞。依照德國(guó)QIAGFN公司的人基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明，提取Fca9706細(xì)胞基因組。

1.3 擴(kuò)增并純化目的基因上游和下游同源序列根據(jù)GenBank中DNA polβ基因序列（M13140），利用UCSC中Blat分析工具軟件分析DNA polβ基因的所有內(nèi)含子、外顯子以及啟動(dòng)子序列；選擇DNA polβ敲除序列上游和下游同源重組區(qū)；設(shè)計(jì)并合成上游同源重組區(qū)（UP）和下游同源重組區(qū)（DOWN）PCR引物；以Fca9706細(xì)胞基因組 DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。目的DNA通過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，按照快速凝膠回收試劑盒的操作說(shuō)明，回收該基因片段，此即獲得純化的上游同源序列（UP）。下游同源序列（DOWN）的純化過(guò)程與此相同。

1.4 T-A克隆將上游同源序列（UP）和下游同源序列（DOWN）的純化產(chǎn)物分別克隆入pGFM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，通過(guò)藍(lán)白篩選，挑選白色菌落進(jìn)行PCR和酶切鑒定，即獲得了陽(yáng)性重組質(zhì)粒pGFM-TDOWN和pGFM-T-UP。

1.5 構(gòu)建質(zhì)粒pOUT-DOWN用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pcDNA3.1和鑒定正確的pGFM-T-DOWN，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ/HindⅢ雙酶切后，分別回收大片段（pcDNA3.1）和小片段（DOWN），具體步驟參照膠回收純化試劑盒。在T4 DNA連接酶的作用下，室溫連接2 h，產(chǎn)生重組質(zhì)粒pOUT-DOWN。經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ/HindⅢ雙酶切鑒定后，篩選出鑒定正確細(xì)菌，并將其接種于5 mL含有氨芐青霉素（A+）的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)菌，最后再用質(zhì)粒提取試劑盒提取構(gòu)建成功的質(zhì)粒pOUT-DOWN。

1.6 構(gòu)建轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒pOUT-polβ提取質(zhì)粒pOUTDOWN和pGFM-T-UP，分別用XhoⅠ/ApaⅠ雙酶切，獲得線(xiàn)性化的pOUT-DOWN和小片段（UP）用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物再用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，室溫連接2 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α中，再在含氨芐青霉素的LB平板上隨機(jī)挑取5個(gè)單菌落，通過(guò)酶切和PCR擴(kuò)增，篩選得到基因敲除質(zhì)粒pOUT-polβ。基因敲除載體結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 基因敲除載體pOUT-polβ結(jié)構(gòu)示意圖

2 結(jié)果

2.1 基因敲除序列UP區(qū)段和DOWN區(qū)段擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增Fca9706細(xì)胞基因組DNA，分別得到UP和DOWN同源序列。下游同源序列DOWN擴(kuò)增產(chǎn)物，長(zhǎng)度約為1 756 bp（圖2）；上游同源序列UP擴(kuò)增產(chǎn)物，長(zhǎng)度約為1 280 bp（圖3）。

圖2 DNA polβ下游同源序列DOWN的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 上游和下游基因敲除同源序列與pGEM-T載體克隆重組子鑒定結(jié)果以T7/SP6為引物，PCR擴(kuò)增鑒定重組載體pGFM-T-UP，pGFM-T-DOWN，分別得到約為1 444 bp（UP）和1 932 bp（DOWN）的陽(yáng)性克隆擴(kuò)增片段。見(jiàn)圖4、5。

圖3 DNA polβ上游同源序列的擴(kuò)增結(jié)果

圖4 重組質(zhì)粒pGFM-T-up，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖5 重組質(zhì)粒pGFM-T-down擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 骨架載體pcDNA3.1與下游同源序列DOWN重組結(jié)果用限制性核酸酶切酶BglⅡ/HindⅢ雙酶切該重組載體，電泳可見(jiàn)，在同一泳道上有2條明亮條帶分別位于1 756 bp處和3 622 bp處，與設(shè)計(jì)一致。見(jiàn)圖6。

圖6 骨架載體pcDNA3.1與下游同源序列DOWN重組結(jié)果

2.4 基因敲除重組載體pOUT-polβ鑒定結(jié)果用引物UP1/UP2，PCR擴(kuò)增鑒定；限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ/ApaⅠ、BglⅡ/HindⅢ雙酶切鑒定，F(xiàn)coR V單酶切鑒定，驗(yàn)證下游和上游同源序列是否正確插入到骨架載體中。電泳結(jié)果與設(shè)計(jì)一致。見(jiàn)圖7、8。

圖7 引物UP1/UP2擴(kuò)增鑒定結(jié)果

2.5 線(xiàn)性化基因敲除載體鑒定結(jié)果提取鑒定正確的基因敲除重組載體，經(jīng)FcoR V酶切使其線(xiàn)性化，電泳結(jié)果顯示，有一條明亮條帶位于5 428 bp處。見(jiàn)圖9。

圖8 酶切鑒定重組質(zhì)粒電泳結(jié)果

圖9 線(xiàn)性化基因打靶載體經(jīng)酶切鑒定結(jié)果

3 討論

隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，基因研究的熱點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)向基因及其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能。通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞模型，采用目的基因過(guò)量表達(dá)和（或）反義抑制等方法來(lái)研究基因的生理學(xué)功能。但反義抑制不能完全消除細(xì)胞內(nèi)源基因的表達(dá)作用，往往對(duì)結(jié)果分析造成一定干擾。基因敲除通過(guò)同源重組，將細(xì)胞特定基因破壞，從而造成該基因功能喪失，能夠完全消除細(xì)胞內(nèi)源基因的干擾。體細(xì)胞基因敲除技術(shù)，由于其去除了動(dòng)物胚胎操作以及交配繁殖生長(zhǎng)等過(guò)程，從而大大縮短時(shí)間，因此，體細(xì)胞基因敲除技術(shù)已成為一種研究特定人體基因生理學(xué)功能的高效快速特異的方法。

由于同源重組的過(guò)程中存在著重組效率低，以及目的片段的隨機(jī)插入等諸多因素的影響，所以，基因敲除載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建以及篩選系統(tǒng)的選擇將直接影響到基因敲除策略和效率［21］，并且決定著整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的成敗。本研究所構(gòu)建的基因敲除載體全長(zhǎng)約7.8 kb，基因結(jié)構(gòu)為-5’上游同源序列-neo-下游同源序列-3’-，其中上游同源序列長(zhǎng)約1 268 bp，下游同源序列長(zhǎng)約2 150 bp，包含了DNA polβ基因第1、2、3外顯子和第1、2內(nèi)含子的全部以及第3內(nèi)含子的大部分，并且還包含了DNA polβ基因啟動(dòng)子的一部分。選用neo基因作為選擇標(biāo)志基因，利用含有正篩選基因neo來(lái)提高同源重組率，若同源重組如期發(fā)生，基因敲除載體的同源序列將取代與DNA polβ基因相應(yīng)的同源區(qū)，而且，由于DNA polβ基因外顯子的一部分也在同源重組的過(guò)程中被敲除［22-23］，這樣將導(dǎo)致DNA polβ基因功能的喪失。構(gòu)建成功基因敲除載體通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶切的圖譜分析及測(cè)序證實(shí)，符合預(yù)期設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)。將此基因敲除載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，與靶基因發(fā)生同源重組。通過(guò)G-418篩選，最終獲得DNA polβ基因缺失的細(xì)胞模型，這為后續(xù)研究人食管癌DNA polβ的生物學(xué)功能工作打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

［1］ Srivastava DK，Husain I，Arteaga CL，et al.DNA polymerase beta expression differences in selected human tumors and cell lines［J］. Carcinogenesis，1999，20（6）：1049-1054.

［2］ 任昀.DNA聚合酶β和腫瘤［J］.癌變·畸變·突變，2004，16（2）：125-128.

［3］ Bhattacharyya N，Chen HC，Grundfest-Broniatowski S，et al.Alteration of hMSH2 and DNA polymerase beta genes in breast carcinomas and fibroadenomas［J］.Biochem Biophys Res Commun，1999，259（2）：429-435.

［4］ Iwanaga A，Ouchida M，Miyazaki K，et al.Functional mutation of DNA polymerase beta found in human gastric cancer--inability of the base excision repair in vitro［J］.Mutat Res，1999，435（2）：121 -128.

［5］ Fydmann MF，Knowles MA.Mutation analysis of 8p genes POLB and PPP2CB in bladder cancer［J］.Cancer Genet Cytogenet，1997，93（2）：167-171.

［6］ Bergerheim US，Kunimi K，Collins VP，et al.Deletion mapping of chromosomes 8，10，and 16 in human prostatic carcinoma［J］. Genes Chromosomes Cancer，1991，3（3）：215-220.

［7］ Dobashi Y，Shuin T，Tsuruga H，et al.DNA polymerase beta gene mutation in human prostate cancer［J］.Cancer Res，1994，54（11）：2827-2829.

［8］ Hübscher U，Nasheuer HP，Syv?oja JF.Fukaryotic DNA polymerases，a growing family［J］.Trends Biochem Sci，2000，25（3）：143-147.

［9］ Iwanaga A，Ouchida M，Miyazaki K，et al.Functional mutation of DNA polymerase beta found in human gastric cancer--inability of the base excision repairin vitro［J］.Mutat Res，1999，435（2）：121 -128.

［10］董子明，趙國(guó)強(qiáng)，趙勤，等.人食管癌組織中DNA聚合酶β基因突變的研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2002，82（13）：899-902.

［11］Srivastava DK，Husain I，Arteaga CL，et al.DNA polymerase beta expression differences in selected human tumors and cell lines［J］. Carcinogenesis，1999，20（6）：1049-1054.

［12］Capecchi MR.Altering the genome by homologous recombination［J］.Science，1989，244（4910）：1288-1292.

［13］董子明.DNA聚合酶β的研究現(xiàn)狀［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2003，38（4）：477-479.

［14］Sedivy JM，Dutriaux A.Gene targeting and somatic cell genetics--a rebirth or a coming of age？［J］.Trends Genet，1999，15（3）：88-90.

［15］Sedivy JM.Gene targeting comes to top-down drug screens［J］. Trends Biotechnol，2002，20（3）：92-93.

［16］Brown JP，Wei W，Sedivy JM.Bypass of senescence after disruption of p21CIP1/WAF1 gene in normal diploid human fibroblasts［J］. Science，1997，277（5327）：831-834.

［17］Chan TA，Hermeking H，Lengauer C，et al.14-3-3Sigma is required to prevent mitotic catastrophe after DNA damage［J］.Nature，1999，401（6753）：616-620.

［18］Park BH，Vogelstein B，Kinzler KW.Geneticd isruption of PPARdelta decreases the tumorigenicity of human colon cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（5）：2598-2603.

［19］Li G，Nelsen C，Hendrickson FA.Ku86 is essential in human somatic cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（2）：832 -837.

［20］Shulman MJ，Nissen L，Collins C.Homologous recombination in hybridoma cells：dependence on time and fragment length［J］.Mol Cell Biol，1990，10（9）：4466-4472.

［21］Thomas KR，Capecchi MR.Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells［J］.Cell，1987，51（3）：503-512.

［22］生秀杰.基因打靶的策略及其發(fā)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：遺傳學(xué)分冊(cè)，2001，24（1）：8-10.

［23］Zhang Y，Yuan F，Wu X，et al.Preferential incorporation of G opposite template T by the low-fidelity human DNA polymerase iota［J］.Mol Cell Biol，2000，20（19）：7099-7108.

Construction of Eca9706 Cell DNA Polβ Gene Targeting Vector

Feng Long1，2，Guo Wentao3，Lu Wuhao4，Sun Sajia2，Dong Ziming2
（1.College of Basic Medical Science，Henan University of TCM，Zhengzhou 450008，China；2.College of Basic Medical Science，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China；3.Luohe Medical college，Luohe 462002，China；4.The First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

ObjectiveTo construct Fca9706 cell DNA polymerase β（DNA polβ）gene targeting vector.Methods According to the principle of somatic gene targeting and DNA polβ sequence，the two special primers were designed and synthesized（UP1/UP2 and DOWN1/DOWN2）to amplify the up homologous sequence and the down homologous sequence.The up sequence（1 268 bp）and the down sequence（2 150 bp）were inserted into skeleton vector pcDNA3.1，then DNA polβ gene targeting vector pOUT-polβ was constructed.Finally，the targeting vector was identified by PCR，restriction enzyme digestion and sequencing.ResultsThe up sequence and the down sequence were exactly inserted into skeleton vector pcDNA3.1，then DNA polβ gene targeting vector pOUT-polβ was constructed.ConclusionThe Fca9706 cell DNA polβ gene targeting vector was established successfully by using the method in this thesis.

gene targeting；DNA polymerase；targeting vector；Fca9706 cell

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.03.001

R735.1；R730.23

A

1673-5412（2014）03-0185-05

2014-03-14）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：30471952）

馮龍（1981-），女，博士，講師，主要從事腫瘤發(fā)病及病因?qū)W研究。F-mail：flong01@163.com

董子明（1953-），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤病理生理學(xué)相關(guān)研究。F-mail：dongzmzzu@126.com