徐義剛，李丹丹，崔麗春，劉忠梅，李蘇龍

（1.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，黑龍江 哈爾濱 150001；2.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南 海口 570125；3.東北林業(yè)大學(xué)研究生院，黑龍江 哈爾濱 150040）

腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）是大腸桿菌的一個(gè)亞型，主要致病菌株血清型為O157∶H7，呈全球性分布，可產(chǎn)生志賀氏毒素樣細(xì)胞毒素[1-2]。畜禽為本病儲(chǔ)存宿主和主要傳染源，如牛、羊、豬等，以牛帶菌率最高。EHEC O157∶H7傳播途徑復(fù)雜多樣，主要通過(guò)進(jìn)食被污染的食物、水或與病人接觸而傳染，出現(xiàn)腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性貧血和溶血性尿毒綜合征等臨床癥狀[3-6]。常見(jiàn)被污染的食物有牛肉、牛奶及其制品、禽肉、羊肉、蔬菜和水果等，快餐類食品極易造成暴發(fā)性食物中毒。EHEC O157∶H7引起的危害受到廣泛關(guān)注，建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)防控該致病菌具有重要意義。

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法（分離培養(yǎng)結(jié)合生化與血清學(xué)鑒定）檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、敏感性差、嚴(yán)重影響檢測(cè)效率[7-8]。為滿足EHEC O157∶H7快速檢測(cè)要求，研發(fā)出了免疫磁珠富集法[9]、生物傳感器法[10-12]、蛋白芯片[13]、基因芯片[14]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[15-20]、實(shí)時(shí)熒光PCR[21-23]和LAMP[24]等檢測(cè)方法。其中，PCR方法因檢測(cè)快速、靈敏度高，成為主要采用的檢測(cè)方法。引物設(shè)計(jì)是建立有效PCR方法的關(guān)鍵因素，常規(guī)的PCR引物設(shè)計(jì)，不僅需要反復(fù)優(yōu)化引物的各項(xiàng)參數(shù)與反應(yīng)條件，尤其是退火溫度，而且需要反復(fù)比對(duì)引物的特異性，以防止非特異性擴(kuò)增，尤其是涉及多重PCR方法設(shè)計(jì)時(shí)，需要大量的實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證方法的特異性，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。

雙啟動(dòng)寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一種新型的引物設(shè)計(jì)方法：DPO引物分為2個(gè)部分，即長(zhǎng)5’-端（18～25 bp，Tm＞65 ℃）和短3’-端（6～12 bp，GC含量為40%～80%），兩者間用多聚次黃嘌呤連接；基于DPO引物的特殊結(jié)構(gòu)，引物自身以及引物間難形成二級(jí)結(jié)構(gòu)且對(duì)退火溫度不敏感，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不需要對(duì)引物進(jìn)行篩選以及對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，簡(jiǎn)化了引物設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)步驟；擴(kuò)增時(shí)，只要DPO引物5’-端或3’-端有3 個(gè)以上堿基發(fā)生錯(cuò)配，PCR擴(kuò)增就會(huì)終止，有效地阻斷了非特異性擴(kuò)增，特異性更強(qiáng)[25-28]。本研究利用該技術(shù)，建立了EHEC O157∶H7基于DPO引物的PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究所用實(shí)驗(yàn)菌株有：腸出血性大腸桿菌O157∶H7 ATCC 35150、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌ATCC 35401、腸侵襲性大腸桿菌ATCC 43893、腸致病性大腸桿菌ATCC 43887、大腸桿菌ATCC 25922、阪崎腸桿菌ATCC 51329、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC 19111、嗜水氣單胞菌ATCC 7966、空腸彎曲菌ATCC 33560、變形桿菌ATCC 49027、沙門氏菌ATCC 10708、志賀氏菌ATCC 12022、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌ATCC 9610、粘質(zhì)沙雷菌ATCC 14756、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031、霍亂弧菌ATCC 14035、副溶血弧菌ATCC 27519、溶藻弧菌ATCC 33839和創(chuàng)傷弧菌ATCC 33149 美國(guó)典型菌種保藏中心（ATCC）；溶血性鏈球菌CMCC 32121 中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心（CMCC）；腸出血性大腸桿菌O157∶H7分離株2 株、擬態(tài)弧菌分離株1 株和大腸桿菌分離株2 株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；Taq DNA Polymerase、dNTP、MgCl2日本TaKaRa公司；復(fù)合增菌培養(yǎng)基BPW 北京蘭伯瑞生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

以腸出血性大腸桿菌O157∶H7 rfbE基因?yàn)榘谢颍?jīng)BLAST分析，選取rfbE基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)DPO引物，詳見(jiàn)表1，引物由上海生工生物工程公司合成。

表 1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.2 細(xì)菌DNA提取

將1.1.1節(jié)中的菌株分別接種于5 mL BPW培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，取1 mL菌液，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DPO-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

反應(yīng)體系為25 L：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 L；Mg2+（25 mmol/L）用量范圍為0.5～5.0 L，以0.5 L遞增；dNTP（2.5 mmol/L for each）用量范圍為0.25～2.5 L，以0.25 L遞增；Taq DNA Polymerase （5 U/ L）用量范圍為0.05～0.5 L，以0.05 L遞增；DPO引物（上、下游各10 mol/L）用量范圍為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 L；細(xì)菌DNA 模板1 L，去離子水補(bǔ)充至25 L。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57.5 ℃ 45 s，72 ℃45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

1.2.4 DPO-PCR退火溫度不敏感性實(shí)驗(yàn)

將退火溫度范圍設(shè)為45～65 ℃，進(jìn)行DPO-PCR反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增效果，并與常規(guī)PCR引物進(jìn)行比較。

1.2.5 DPO-PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)

將菌體濃度約為9.4×106CFU/mL的EHEC O157∶H7進(jìn)行10倍梯度稀釋，提取每級(jí)稀釋度EHEC O157∶H7的基因組DNA，以此為模板進(jìn)行DPO-PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定檢測(cè)靈敏度。

1.2.6 DPO-PCR特異性實(shí)驗(yàn)

利用建立的DPO-PCR方法檢測(cè)1.1.1節(jié)所示菌株以及小鼠、雞、鵝和豬腸道細(xì)菌（經(jīng)檢測(cè)不含EHEC O157∶H7）宏基因組，以驗(yàn)證本方法的特異性，并與常規(guī)PCR引物進(jìn)行比較。

1.2.7 方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR檢測(cè)方法應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐工作中，以檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 0973—2010《進(jìn)出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌O157∶H7檢測(cè)方法》）檢測(cè)結(jié)果作為參照，驗(yàn)證其可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 EHEC O157∶H7 DPO-PCR檢測(cè)方法的建立

以EHEC O157∶H7 rfbE基因?yàn)榘谢颍O(shè)計(jì)一對(duì)DPO引物，經(jīng)反應(yīng)體系的優(yōu)化，建立了EHEC O157∶H7 DPOPCR檢測(cè)方法，優(yōu)化后的反應(yīng)體系為（25 L）：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 L，Taq DNA Polymerase（5 U/ L）0.1 L（圖1A中2泳道），Mg2+（25 mmol/L）2.5 L（圖1B中5泳道），dNTP（2.5 mmol/L）1.5 L（圖1C中6泳道），上、下游DPO引物（10 mol/L）各0.5 L（圖1D中5泳道），DNA模板1 L，去離子水補(bǔ)充至25 L。

圖 1 EHEC O15577∶H7 DPO-PCR檢測(cè)方法的建立Fig.1 Development of DPO-PCR method for the detection of EHEC O157∶H7

2.2 DPO-PCR退火溫度不敏感性

退火溫度設(shè)為45～65 ℃時(shí)，利用DPO引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增效率隨著退火溫度的變化基本保持一致，而利用常規(guī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增效率隨著退火溫度的升高逐漸增加后下降（圖2），表明DPO引物的退火溫度范圍較寬。

圖 2 DPO引物退火溫度不敏感性Fig.2 Insensitivity of DPO primers to annealing temperature

2.3 DPO-PCR檢測(cè)靈敏度

將菌體濃度為9.4×106CFU/mL的EHEC O157∶H7經(jīng)105倍稀釋后，利用建立的DPO-PCR方法仍能有效擴(kuò)增出目的基因片段（圖3），顯示該DPO-PCR方法檢測(cè)EHEC O157∶H7的靈敏度為94 CFU/mL。

M. DNA marker 2000；1. 9.4×106 CFU/mL；2. 9.4×105 CFU/mL;3. 9.4×104 CFU/mL；4. 9.4×103 CFU/mL；5. 9.4×102 CFU/mL；6. 9.4×101 CFU/mL；7. 9.4×100 CFU/mL。

2.4 DPO-PCR檢測(cè)特異性

利用建立的DPO-PCR方法檢測(cè)1.1.1節(jié)所示細(xì)菌以及小鼠、雞、鵝和豬腸道細(xì)菌宏基因組，結(jié)果顯示：EHEC O157∶H7菌株 （ATCC 35150和2 株分離株）均為DPO-PCR陽(yáng)性結(jié)果，其他為陰性結(jié)果，且未見(jiàn)非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，而利用常規(guī)PCR引物擴(kuò)增出現(xiàn)了與目的基因片段大小相近的非特異性條帶（圖4），表明本研究建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR檢測(cè)方法較常規(guī)PCR特異性更強(qiáng)。

圖 4 EHEC O15577∶H7 DPO-PCR檢測(cè)方法特異性結(jié)果Fig.4 Specificity of DPO-PCR method for EHEC O157∶H7

2.5 方法實(shí)踐驗(yàn)證

利用建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR檢測(cè)方法對(duì)228份采集的樣本進(jìn)行了檢測(cè)，共檢測(cè)出4份EHEC O157∶H7陽(yáng)性樣本，經(jīng)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法（SN/T 0973—2010）復(fù)檢，兩者檢測(cè)結(jié)果一致，見(jiàn)表2，顯示該方法具有良好的實(shí)用性。

表 2 方法實(shí)踐應(yīng)用Table 2 Detection of EHEC O157 H7 in real samples by the DPO-PCR method

3 結(jié) 論

DPO引物與常規(guī)PCR引物相比，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)易，不需要對(duì)引物參數(shù)進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化，在45～65 ℃的退火溫度范圍內(nèi)，DPO引物均能保持高效率擴(kuò)增。此外，DPO引物中的次黃嘌呤堿基的氫鍵結(jié)合力弱，在DPO引物引導(dǎo)PCR擴(kuò)增時(shí)，如果5'-端或3'-端存在3 個(gè)以上堿基錯(cuò)配，DPO引物便會(huì)與DNA模板發(fā)生脫離，終止PCR反應(yīng)，有效地阻斷非特異性擴(kuò)增，增加了檢測(cè)特異性，而且DPO引物自身以及引物間難形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高了擴(kuò)增效率。實(shí)踐應(yīng)用證明，本研究建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)快速、結(jié)果準(zhǔn)確，具有良好的實(shí)用性。

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