曹際娟，徐君怡，曹冬梅，張丕橋,2，欒鳳俠，劉 洋

（1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001；2.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116029；3.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 哈爾濱 150001）

隨著轉(zhuǎn)基因作物的不斷商業(yè)化，轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題已逐漸成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。世界各國都在努力制定相應(yīng)的法律和法規(guī)，以加強(qiáng)對進(jìn)出口轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的管理。轉(zhuǎn)基因生物檢測技術(shù)是安全評(píng)價(jià)的關(guān)鍵之一[1]。轉(zhuǎn)基因檢測已成為市場準(zhǔn)入的重要檢測指標(biāo)。目前，應(yīng)用最為廣泛的是基于核酸水平的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和實(shí)時(shí)PCR檢測技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品通用元件的篩查檢測[2]，對目的基因的特異性檢測[3]，對轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建的特異性檢測[4]，以及對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品轉(zhuǎn)化事件側(cè)翼序列的特異性檢測（即品系鑒定）[5]。隨著進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展，僅僅確定是否含有轉(zhuǎn)基因成分已無法滿足需要，還要確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品是否被輸入國所批準(zhǔn)，即進(jìn)行轉(zhuǎn)化事件的品系鑒定，特別是在進(jìn)出口貿(mào)易中新出現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品低水平混雜（low level presence，LLP）問題[6]，更需要精準(zhǔn)的檢測方法作技術(shù)保障，這成為國際上轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢[7]。小麥作為世界主要糧食來源，其種植面積、總產(chǎn)量和總貿(mào)易額均居各類作物之首，其轉(zhuǎn)基因遺傳改良受到廣泛關(guān)注[8]。從1992年第一株轉(zhuǎn)基因小麥在美國問世至今20多年來，國內(nèi)外應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對小麥進(jìn)行了大量研究，并在抗蟲、抗旱、抗病毒、雄性不育、品質(zhì)改良等方面取得了很多成績[9-13]。轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1和B72-8-11b是由基因槍將p1Dx5、pAHC25兩個(gè)質(zhì)粒通過共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入普通小麥品種中得到的[10]。B73-6-1的p1Dx5質(zhì)粒攜帶高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基HMW-GS基因、B72-8-11b的p1Dx5質(zhì)粒攜帶高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基1Dx5基因均可提高面筋含量、改良小麥品質(zhì)，由自身胚乳特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)；pAHC25質(zhì)粒攜帶標(biāo)記基因uidA和抗除草劑基因bar，上游連接廣譜ubiquitin啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)基因小麥B102-1-2品系則是利用基因槍法將pAHc25和pHMW lAxl轉(zhuǎn)化到小麥L88-31上而獲得lAxl基因超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品系，改善了面粉烘烤品質(zhì)[10]。

本研究的目的是建立轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系特異性鑒定的實(shí)時(shí)PCR方法，以辨別具有相同外源基因的不同轉(zhuǎn)基因作物品系，并為進(jìn)出口貿(mào)易中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品LLP問題的出現(xiàn)和解決方案做好技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2粉末樣品由黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局提供；對照樣品轉(zhuǎn)基因玉米Bt176、轉(zhuǎn)基因玉米MON88017、轉(zhuǎn)基因玉米MIR604、轉(zhuǎn)基因大豆89788、轉(zhuǎn)基因稻米LLRice62購于美國油類化學(xué)家學(xué)會(huì)（AOCS）；非轉(zhuǎn)基因小麥京冬小麥6號(hào)、鄂麥18、川麥107非轉(zhuǎn)基因小麥分別購于四川省種子公司、湖北省種子公司、江西省種子公司；GMO DNA提取試劑盒（TaKaRa Code No.D9093）、實(shí)時(shí)PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、dNTP 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7500型實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀 美國ABI公司；Mupid型核酸電泳儀 日本Advance-Bio公司；ND-1000型超微量紫外-可見分光光度計(jì) 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取

樣品粉末分別在液氮中研成細(xì)末，提取基因組DNA。提取的DNA溶于100 L TE緩沖液中，采用超微量分光光度計(jì)對基因組DNA進(jìn)行純度、濃度測定，且OD260nm/OD280nm在1.7～2.0較合適。

1.3.2 引物和探針的設(shè)計(jì)

在文獻(xiàn)[14-16]基礎(chǔ)上，采用Beacon Designer 7.91軟件，分別在跨邊界序列的前端或后端設(shè)計(jì)該3種小麥品系鑒定的引物和探針（表1）。引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。探針的5’端標(biāo)記羧基熒光素（FAM），3’端標(biāo)記非熒光染料淬滅報(bào)告基團(tuán)（Eclipse）。

表 1 小麥內(nèi)源基因及3種轉(zhuǎn)基因小麥品系鑒定的引物和探針序列Table 1 Primers and probes targeting wheat endogenous genes and event specific detection of transgenic wheat strains

1.3.3 實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

25 L的反應(yīng)體系：在0.2 mL的PCR反應(yīng)管中，加入正向引物（10 μmol/L）0.8 μL、反向引物（10 μmol/L）0.8 μL、探針（10 μmol/L）1 μL、2×PCR預(yù)混合緩沖液（含Mg2+和dNTPs 0.4 mmol/L，Ex Taq HS 1.25 U/25 μL）12.5 μL、模板DNA（0.1～2 μg）2 μL，水補(bǔ)足至25 μL。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃，3 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；40 個(gè)循環(huán)。

1.3.4 靈敏度檢測

以實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定B73-6-1品系為例進(jìn)行靈敏性實(shí)驗(yàn)。研磨B73-6-1品系樣品并過80 目篩處理后，以不同質(zhì)量分別添加到非轉(zhuǎn)基因小麥粉基質(zhì)中，制備成轉(zhuǎn)基因含量為10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.007%、0.005%、0.003%、0.001%（m/m）的共10 個(gè)梯度添加樣品，分別進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 模板gDNA的定量檢測和小麥內(nèi)源基因的擴(kuò)增

各取轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2和京冬小麥6號(hào)等基因組DNA 1 L，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測基因組DNA純度。此外，各取1 μL基因組DNA，使用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行純度、濃度鑒定。由圖1、表2可見，基因組DNA純度和濃度均符合實(shí)時(shí)PCR檢測要求。

圖 1 部分模板gDNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 One percent agarose gel of electrophoresis the template gDNA

表 2 3 種轉(zhuǎn)基因小麥基因組DNA純度和濃度Table 2 Purities and concentrations of the genomic DNAs isolated from three transgenic wheat strains

為進(jìn)一步驗(yàn)證小麥模板gDNA的提取效果，采用Wx012F/Wx012R引物和Wx012P探針，經(jīng)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增小麥種內(nèi)源的Wx012基因。每個(gè)樣品進(jìn)行2次重復(fù)，結(jié)果如圖2所示。轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2以及對照的非轉(zhuǎn)基因小麥（京冬小麥6號(hào)、鄂麥18、川麥107）均檢測出熒光增幅曲線，而對照樣品非小麥樣品（轉(zhuǎn)基因玉米Bt176、轉(zhuǎn)基因玉米MON88017、轉(zhuǎn)基因玉米MIR604、轉(zhuǎn)基因大豆89788、轉(zhuǎn)基因稻米LLRice62等）均未出現(xiàn)熒光增幅現(xiàn)象，表明Wx012F/Wx012R引物和Wx012P探針具有檢測小麥內(nèi)源基因的特異性，可用于轉(zhuǎn)基因小麥檢測中的內(nèi)源質(zhì)控。

圖 2 小麥內(nèi)源基因的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增圖譜Fig.2 Real-time PCR amplification plot of wheat endogenous genes

2.2 品系特異性檢測結(jié)果

2.2.1 實(shí)時(shí)PCR特異性鑒定B73-6-1品系

使用B73F/B73R引物和B73P探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2品系及對照樣品和非轉(zhuǎn)基因小麥的基因組DNA，每個(gè)樣品進(jìn)行6次重復(fù)。由圖3A可見，B73F/B73R引物和B73P探針僅檢測出轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1品系的熒光增幅曲線，而其他樣品均未出現(xiàn)熒光增幅現(xiàn)象，表明B73F/B73R引物和B73P探針具有檢測轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1品系的特異性。

圖 3 轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1（A）、B72-8-11b（B）、B102-1-2（C）品系特異性的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增圖譜Fig.3 Amplification plots of event-specific real-time PCR for transgenic wheat strain B73-6-1 (A)、B72-8-11b (B)、B102-1-2 (C)

2.2.2 實(shí)時(shí)PCR特異性鑒定B72-8-11b品系

使用B72F/B72R引物和B72P探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增檢測轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2品系及對照樣品和非轉(zhuǎn)基因小麥的基因組DNA。每個(gè)樣品進(jìn)行6 次重復(fù)。由圖3B結(jié)果可見，B72F/B72R引物和B72P探針僅檢測出轉(zhuǎn)基因小麥B72-8-11b品系的熒光增幅曲線，而其他樣品均未出現(xiàn)熒光增幅現(xiàn)象，表明B72F/B72R引物和B72P探針具有檢測轉(zhuǎn)基因小麥B72-8-11b品系的特異性。

2.2.3 實(shí)時(shí)PCR特異性鑒定B102-1-2品系

使用B102F/B102R引物和B102P探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2品系及對照樣品和非轉(zhuǎn)基因小麥的基因組DNA。每個(gè)樣品進(jìn)行6 次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線見圖3C。由圖3C可見，B102F/B102R引物和B102P探針僅檢測出轉(zhuǎn)基因小麥B102-1-2品系的熒光增幅曲線，而其他樣品均未出現(xiàn)熒光增幅現(xiàn)象，表明B102F/B102R引物和B102P探針具有檢測轉(zhuǎn)基因小麥B102-1-2品系的特異性。

2.3 實(shí)時(shí)PCR檢測靈敏度結(jié)果

以B73-6-1品系為例，測定本方法的檢測限，結(jié)果如圖4所示。本方法對B73-6-1品系樣品的檢測限可以達(dá)到0.01%（m/m），而0.007%含量以下的樣品則熒光信號(hào)在基線以下，屬于陰性結(jié)果。DNA提取和實(shí)時(shí)熒光PCR的過程均重復(fù)了6 次，結(jié)果都一致。

圖 4 B73-6-1品系的實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度檢測圖譜Fig.4 Real-time PCR amplification plots for its sensitivity for detection of transgenic wheat strain B73-6-1

3 討 論

由于小麥?zhǔn)钱愒戳扼w作物，基因組中含有A、B、D 3組染色體，其中3組染色體中An、Bn、Dn同源基因之間具有很強(qiáng)的互補(bǔ)性，使得小麥的遺傳機(jī)理更復(fù)雜[18-20]，所以轉(zhuǎn)基因小麥的研究比其他轉(zhuǎn)基因作物更加困難。品系鑒定的轉(zhuǎn)化事件特異檢測是通過擴(kuò)增側(cè)翼序列（受體基因組和插入DNA的連接區(qū)域）來鑒定含有相同外源DNA的不同轉(zhuǎn)基因生物[5]。轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2是由Barro等[10]于1997年構(gòu)建成功，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，已有篩選檢測方法的文獻(xiàn)[21]報(bào)道，也有通過染色體步移測序技術(shù)獲取了此3種轉(zhuǎn)基因小麥的側(cè)翼序列，并建立了PCR鑒定方法的報(bào)道[14-16]。然而PCR方法中擴(kuò)增產(chǎn)物需要電泳檢測，操作繁瑣，易引發(fā)污染和假性結(jié)果。而實(shí)時(shí)熒光PCR具有快捷、準(zhǔn)確的優(yōu)勢，已有廣泛應(yīng)用該技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的文獻(xiàn)報(bào)道[23-25]。為此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，分別在跨邊界序列的前端或后端重新設(shè)計(jì)該3種小麥品系鑒定的引物和探針，經(jīng)過特異性實(shí)驗(yàn)和靈敏度實(shí)驗(yàn)，建立了簡便、快捷、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因小麥品系特異性鑒定的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，為特異性鑒定轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系提供了更為有效的方法。這將為準(zhǔn)確、快速、高效地檢測轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)制定和試劑盒的開發(fā)提供技術(shù)支持，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

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