趙 靜，王 娜，馮敘橋1,,*，趙宏俠，黃曉杰,4

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013；2.美國加州大學(xué)戴維斯分校環(huán)境毒理系，美國 加州 戴維斯 95616；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；4.遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

硝酸鹽和亞硝酸鹽廣泛的存在于人們的生活中，在2001年正式實(shí)施的農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，農(nóng)產(chǎn)品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的限量已經(jīng)作為重要指標(biāo)列入其中了。如今，硝酸鹽的含量更是作為評價(jià)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)[1]。亞硝酸鹽是一種有毒物質(zhì)，作為防腐劑廣泛地應(yīng)用于各類食品中，是嫩肉粉、肉類保水劑和香腸改良劑等肉制品添加劑的必用配料[2]。盡管亞硝酸鹽在改善肉制品的色澤和貨架期方面發(fā)揮了重要作用，但是亞硝酸鹽對人體的不良影響也不容忽視。過量的亞硝酸鹽進(jìn)入人體內(nèi)，會導(dǎo)致人體出現(xiàn)缺氧及腸源性青紫癥狀，甚至還會造成致癌致畸等危害[3]。蔬菜作為重要的人體維生素和纖維素的攝入來源，在人們的日常膳食中占有重要的地位，其質(zhì)量安全問題更是涉及到每個(gè)人的健康。在食品質(zhì)量與安全高度受到重視的今天，準(zhǔn)確檢測蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量，指導(dǎo)人們食用新鮮無害的蔬菜，對廣大群眾的健康有著重要的意義。

1 蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的來源

蔬菜是一種易于富集硝酸鹽的植物，人類攝入的80%以上的硝酸鹽都來自于蔬菜，過量施用氮肥、長期貯藏、腌漬、烹飪熟化等都會致使蔬菜中的硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[4]。正確認(rèn)識蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的來源，對于通過適當(dāng)?shù)姆椒ǎ行У販p少硝酸鹽和亞硝酸鹽在蔬菜中的含量十分必要。

1.1 過量施用氮肥

新鮮蔬菜中的硝酸鹽主要來源于種植過程中過量施用的氮肥[5]。據(jù)報(bào)道，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中造成蔬菜硝酸鹽積累的原因很多，包括蔬菜的品種、土壤、溫度、光照等，其中氮肥種類及其用量是影響硝酸鹽積累最主要的外在因素，蔬菜中的硝酸鹽81.2%來自蔬菜種植過程中氮肥的施用[6]。一些菜農(nóng)為了獲得蔬菜高產(chǎn)，便盲目、超量地施用氮肥，過量施用氮肥導(dǎo)致蔬菜硝態(tài)氮吸收與還原轉(zhuǎn)化不平衡是產(chǎn)生積累的根本原因[7]。未被蔬菜吸收利用的過剩氮肥以硝酸鹽的形式貯藏在蔬菜中，致使蔬菜中的硝酸鹽累積量增加，在之后的貯藏、加工、食用過程中，硝酸鹽經(jīng)細(xì)菌的作用被還原成亞硝酸鹽[8]。

肥料的合理施用，是減少蔬菜中硝酸鹽積累的一個(gè)有效措施。張樂平等[9]以葉類蔬菜為研究對象，探討氮肥減施對蔬菜的硝酸鹽積累及品質(zhì)影響。結(jié)果表明：在減少20%的化學(xué)氮肥施用的基礎(chǔ)上，通過增施有機(jī)肥、配施微量元素、施用硝化抑制劑等農(nóng)藝技術(shù)措施可降低蔬菜硝酸鹽含量2.93%～22.05%，亞硝酸鹽含量9.09%～53.17%。因此，蔬菜種植過程中，應(yīng)減少氮肥施用，采用有機(jī)肥并配施微量元素等合理施肥技術(shù)，來有效減少蔬菜中硝酸鹽的積累。

1.2 蔬菜腌制

生、鮮白菜等蔬菜中通常含有一定量的硝酸鹽，在長期貯藏特別是腌漬加工過程中，由于硝酸還原菌的作用被還原成亞硝酸鹽，隨后自然分解。據(jù)孟良玉等[10]研究報(bào)道，北方居民家庭酸菜腌制的過程中，隨著腌漬時(shí)間的延長，亞硝酸鹽含量不斷上升，在第6天升至最高，隨后逐漸下降，大約20 d后基本徹底分解（圖1）。因此，從食品安全的角度考慮，腌漬菜應(yīng)該在腌漬至少20 d后食用，才能避免因?yàn)槭卟穗鐫n而產(chǎn)生的亞硝酸鹽對人體帶來的危害。

圖 1 酸菜中亞硝酸鹽含量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系[[1100]]Fig.1 Relationship between nitrite content and fermentation time of pickled cabbage[10]

1.3 隔夜剩菜

烹飪好的蔬菜，營養(yǎng)含量比較高，容易被微生物所利用。如果隔夜放置，空氣中的微生物（如硝酸還原菌）進(jìn)入到蔬菜中，微生物就會利用其中的營養(yǎng)成分而大量繁殖，在這過程中會產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，把蔬菜中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽[11]。梁平[12]曾探究了不同溫度條件下存放不同時(shí)間后烹飪白菜剩菜中亞硝酸鹽含量的變化，結(jié)果顯示：無論在室溫還是在低溫條件下存放白菜剩菜，亞硝酸鹽含量均隨著時(shí)間的延長顯著增加。在室溫存放24 h，白菜剩菜中亞硝酸鹽含量增加了600%，即使在冰箱存放，亞硝酸鹽含量也增加了340%（表1）。說明烹飪好的蔬菜隔夜放置會使其中的亞硝酸鹽含量劇增，不宜食用。

表 1 不同時(shí)間、不同溫度條件下烹飪白菜剩菜中亞硝酸鹽含量[12]Table 1 Nitrate content in cooked Chinese cabbage leftovers under different storage time and temperature conditions[12]

1.4 采后長期貯藏

蔬菜在新鮮狀態(tài)下，亞硝酸鹽含量很低。如果存放在低溫（0～15 ℃）、通風(fēng)良好的條件下，硝酸鹽和亞硝酸鹽含量會緩慢地升高。如果存放條件差、溫度高、時(shí)間長，細(xì)菌生長繁殖快，蔬菜易萎蔫、發(fā)霉、腐爛，使硝酸鹽和亞硝酸鹽含量激增[11]。宋犇等[13]研究了不同貯藏方式下小白菜、菠菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小白菜亞硝酸鹽和硝酸鹽在貯藏時(shí)的起始含量分別為2.1 mg/kg和1 325 mg/kg，在5 ℃條件下貯藏4 d時(shí)，分別達(dá)到6.0 mg/kg與1 980 mg/kg，增長幅度分別為3 倍與1.5 倍；在25 ℃條件下貯藏4 d時(shí)，分別達(dá)到6.7 mg/kg與3 327 mg/kg，增長幅度為3.2 倍與2.5 倍（表2和表3）。因此貯藏新鮮蔬菜時(shí)，要盡量采用低溫并且貯藏時(shí)間不宜過長。

表 2 不同貯藏溫度對小白菜、菠菜亞硝酸鹽含量的影響[13][13]Table 2 Effect of storage temperature on nitrite content in Chinese Table 2 Effect of storage temperature on nitrite content in Chinese cabbage and spinachach[13] [13]mg/kg

表 3 不同貯藏溫度對小白菜、菠菜硝酸鹽含量的影響[13][13]Table 3 Effect of storage temperature on nitrate content in Chinese Table 3 Effect of storage temperature on nitrate content in Chinese cabbage and spinachach[13][13]mg/kg

1.5 其他因素

蔬菜中的硝酸鹽還可以來自于大氣環(huán)境中的吸收、植物固氮菌的作用和農(nóng)業(yè)灌溉的水源中[14]。其次，環(huán)境中化肥的施用、垃圾、污水灌溉、工業(yè)含氮廢棄物、燃料燃燒排放的含氮廢氣等在自然條件下經(jīng)降水淋溶分解后形成硝酸鹽，流入河、湖并滲入地下從而造成有些地區(qū)的飲用水中硝酸鹽含量比較高，導(dǎo)致蔬菜烹飪后硝酸鹽含量升高[15]。此外，蔬菜烹飪后在不潔的餐具中放置過久，硝酸鹽就會被還原菌還原成亞硝酸鹽，這也是蔬菜中亞硝酸鹽產(chǎn)生的一個(gè)原因[16]。

2 亞硝酸鹽對人體的危害

亞硝酸鹽對人體存在直接和潛在的危害。直接危害是急性中毒，人體口服200～500 mg亞硝酸鹽即可引起中毒，口服1 000～2 000 mg就會死亡。潛在的危害是亞硝酸鹽可以與食物或胃中的仲胺類物質(zhì)作用轉(zhuǎn)化為亞硝胺，誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變。此外，還會引起腸源性青紫癥、致畸等危害[17]。亞硝酸鹽的毒性研究一般是根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)研究得出結(jié)果，常以小白鼠為實(shí)驗(yàn)對象，通過向其注射不同劑量的亞硝酸鹽，觀察其生理變化，從而測定亞硝酸鹽的毒性，表4列出了亞硝酸鹽對大鼠的致癌，通過胎盤致畸、致癌的作用[18]。不同種屬對亞硝酸鹽毒性耐受力的差異很大，人對亞硝酸鹽最為敏感，LD50為22 mg/kg，肉鴨對亞硝酸鹽的毒性耐受力比較強(qiáng)，牛羊的耐受力最強(qiáng)，LD50最大值達(dá)到了7 500 mg/kg[19-20]（表5）。WTO/FAO規(guī)定硝酸鹽和亞硝酸鹽的日容許攝入量分別為432 mg/kg和4 mg/kg[21]，如果亞硝酸鹽攝入過量，就會引起腸源性青紫癥、通過產(chǎn)生亞硝胺而致癌、致畸等嚴(yán)重后果。

表 4 亞硝酸鹽的毒性[1188]]Table 4 Nitrite toxicity[1188]

表 5 亞硝酸鹽對不同種屬的毒性[19-20]Table 5 Nitrite toxicity in different species[19-20]

2.1 引起腸源性青紫癥

食用了大量硝酸鹽含量較高的蔬菜后，特別是當(dāng)胃腸道功能紊亂或者胃酸濃度較大時(shí)，可使腸道內(nèi)的亞硝酸鹽形成速度過快，機(jī)體來不及分解轉(zhuǎn)化，從而被大量吸收進(jìn)入血液。亞硝酸鹽具有強(qiáng)氧化性，能將血紅蛋白中的二價(jià)鐵氧化為三價(jià)鐵，使正常的亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白而失去運(yùn)氧功能[22]（圖2）。如果血液中有20%的亞鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變成高鐵血紅蛋白，機(jī)體就會出現(xiàn)缺氧癥狀，表現(xiàn)為皮膚黏膜青紫、惡心、頭暈、全身無力，嚴(yán)重者會因呼吸衰竭而死亡[23]。青海醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急救中心于1993年2月—1997年3月，共收治了34例急性亞硝酸鹽中毒患者。臨床表現(xiàn)為不同程度的全身皮膚及黏膜青紫、頭痛、頭暈、惡心、嘔吐等現(xiàn)象，經(jīng)過治療全部痊愈[24]。陳志誠等[25]在亞硝酸鹽中毒臨床分析中提到，在2008年1月—2010年8月，醫(yī)院收治31例因亞硝酸鹽攝入過量導(dǎo)致急性重癥亞硝酸鹽中毒的患兒，臨床表現(xiàn)為口唇發(fā)紫、惡心嘔吐、頭暈、腹痛等。由此可見，亞硝酸鹽對人體的危害不容小覷。

圖 2 亞硝酸鹽致缺氧癥狀示意圖[22]Fig.2 Schematic diagram of hypoxia symptoms induced by nitrite[22]

2.2 生成具有致癌作用的N-亞硝基化合物

蔬菜存放過程中，硝酸鹽在酶和細(xì)菌的作用下而被還原形成的亞硝酸鹽，可與人體攝入的其他食品、醫(yī)藥品、殘留農(nóng)藥等成分中的次級胺（仲胺、叔胺、酰胺及氨基酸）反應(yīng)，在胃腔酸性環(huán)境下通過亞硝化反應(yīng)合成形成強(qiáng)烈致癌物——N-亞硝基化合物，從而誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變[26]。都韶婷等[27]在對蔬菜積累的硝酸鹽對人體健康的影響研究中提到，N-亞硝基化合物可在胃內(nèi)酸性環(huán)境中通過亞硝化反應(yīng)而合成：在酸性環(huán)境中，亞硝酸鹽可以轉(zhuǎn)化為活性亞硝化劑，例如亞硝酐（N2O3）、亞硝酰（異）硫氰酸酯（GN-NCS）、亞硝酰鹵（NOX）或質(zhì)子化的亞硝酸（H2NO2+）等，它們能與二級胺或酰胺發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成N-亞硝基化合物，反應(yīng)如下：

N-亞硝基化合物分為N-亞硝胺和N-亞硝酰胺兩大類。N-亞硝基化合物沒有直接致癌作用，主要是其化學(xué)性質(zhì)活潑容易生成烷基偶氮羥基化合物和氨氮化合物而呈現(xiàn)致癌活性。其致癌機(jī)制研究表明，亞硝胺可引起食管上皮細(xì)胞相關(guān)癌基因抑癌基因發(fā)生改變，促進(jìn)癌變。DNA堿稀釋過濾法證明，N-亞硝基化合物含氮雜環(huán)化借誘發(fā)DNA互補(bǔ)堿對之間交聯(lián)而啟動(dòng)細(xì)胞的癌變[28]。

2.3 致畸

亞硝酸鹽可以通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，特別是6 個(gè)月以內(nèi)的嬰兒對亞硝酸鹽特別敏感，對胎兒有致畸作用。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽的重要代謝產(chǎn)物——亞硝酰胺中甲基以及亞硝基脲可以致使大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物下一代產(chǎn)生畸形，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)畸形[29]。Ivankovic等[30]研究了亞硝基烷基脲的致畸作用，在妊娠的前半期一次注射給大鼠、敘利亞金黃地鼠注射亞硝基甲基脲或亞硝基乙基脲都可引起腦組織和骨骼畸形；若在大鼠妊娠的前三分之一時(shí)期注射前體物質(zhì)即乙基脲加亞硝酸鈉，大多數(shù)鼠生后第一周死于腦水腫，而在妊娠后半期給乙基脲加亞硝酸鈉，所有仔代都死于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。Diwan等[31]給妊娠8 d或12 d的小鼠一次注射0.5 mmol/kg亞硝基乙基脲，引起仔鼠的腦、眼、肢等畸形，同時(shí)發(fā)現(xiàn)亞硝基乙基脲能引起仔鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血壞死，第四腦室腔擴(kuò)大。

3 蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的檢測方法

鑒于硝酸鹽與亞硝酸鹽對人體健康如此重要，并且蔬菜是人體硝酸鹽與亞硝酸鹽的重要來源，因此對蔬菜中硝酸鹽與亞硝酸鹽的含量進(jìn)行檢測有著十分重要的意義。國內(nèi)外檢測蔬菜中的硝酸鹽與亞硝酸鹽的方法多種多樣，主要分為光譜法（spectroscopy）和色譜法（chromatography）兩大類，另外，還有電化學(xué)法、快速檢測法等方法。由于硝酸鹽和亞硝酸鹽對人體的危害性，對其檢測的精度要求特別高。

3.1 光譜法

光譜法中常見的測定蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的方法為分光光度法[32]，分光光度法是基于物質(zhì)對光的選擇性吸收的特點(diǎn)而建立起來的一種分析方法，因其投資相對小、操作較簡便而得到廣泛應(yīng)用，也是GB/T 5009.33—2008《食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定》中所推薦的方法。此外，光譜法中還有苯酚分光光度法、系數(shù)補(bǔ)償雙波長分光光度法和流動(dòng)注射分光光度法等。

分光光度法中最常用的是紫外-可見分光光度法（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis），這一方法的原理是在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化，再與鹽酸乙二胺偶合形成紫紅色染料，之后在最大吸收波長下測定吸光度。亞硝酸鹽分光光度法分析中經(jīng)典的方法是Griess分光光度法，在一定酸度條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酰胺反應(yīng)生成重氮化合物，再與N-（1-萘基）-乙二胺耦合，形成紫紅色耦氮化合物，在540 nm波長處光具有最大吸收[33]。

徐貴華等[34]采用GB/T 5009.33—2008《食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定》中的分光光度法測定大白菜、小白菜等4 種蔬菜中的亞硝酸鹽含量，結(jié)果表明，蔬菜隨著放置時(shí)間的延長，其亞硝酸鹽含量呈上升趨勢，冰箱4 ℃條件下存放能夠有效抑制亞硝酸鹽含量的增加。趙艷霞等[35]采用UV-Vis測定出生菜、小白菜、油菜、菠菜中的亞硝酸鹽平均含量分別為0.326、0.380、0.241、0.310 mg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.11%～4.38%之間，潘國璋等[36]采用UV-Vis測定茄子和芹菜中亞硝酸鹽含量，并與經(jīng)典法萘乙二胺法進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：UV-Vis的線性范圍是0～1.2 g/mL，摩爾吸光系數(shù)是7 732.6 L/（mol·cm），測定結(jié)果令人滿意。關(guān)秀杰等[37]采用此法對白菜、黃瓜、蕓豆和冬瓜中的亞硝酸鹽含量成功地進(jìn)行了測定，得出了以下結(jié)論：1）無論是在室溫還是在低溫條件下，4 種蔬菜中亞硝酸鹽含量均隨貯藏時(shí)間的延長而增加。2）溫度對蔬菜中亞硝酸鹽含量及其變化速率有明顯的影響。在相同的貯藏時(shí)間下，室溫條件下貯藏的蔬菜中亞硝酸鹽含量均高于低溫條件下，而室溫條件下蔬菜中亞硝酸鹽變化速率均明顯大于低溫條件下。3）蔬菜中亞硝酸鹽含量及其變化速率因蔬菜品種不同而存在顯著差異。分光光度計(jì)具有操作簡便、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，樣品經(jīng)過預(yù)處理后，直接采用分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度的測定就可以得知被測物的濃度。這些研究結(jié)果說明，采用分光光度法測定蔬菜中的硝酸鹽與亞硝酸鹽具有方法簡便、快速、準(zhǔn)確、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

苯酚分光光度法是根據(jù)硝酸鹽與苯酚在濃硫酸介質(zhì)中發(fā)生硝化反應(yīng)，生成有色物質(zhì)的原理，應(yīng)用分光光度法測定硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，具有快速、簡單、準(zhǔn)確等特點(diǎn)[38]。葉瑞洪等[39]采用苯酚分光光度法測定菠菜、春菜和木耳中的硝酸鹽與亞硝酸鹽含量，通過低濃度H2O2將食品中的亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，間接測出亞硝酸鹽的含量。結(jié)果表明：硝酸鹽的檢出限為0.25 g/mL，精密度為0.424%；亞硝酸鹽的檢出限為0.61 g/mL，精密度為0.341%；硝酸鹽和亞硝酸鹽加標(biāo)回收率為91.6%～104%，說明該方法具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。

系數(shù)補(bǔ)償雙波長分光光度法是采用硝酸鹽和亞硝酸鹽的參比波長以及用參比波長求出補(bǔ)償系數(shù)的一種分光光度法，劉瑟容等[40]將此法應(yīng)用于菠菜、生菜、芹菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的同時(shí)測定，在濃硫酸介質(zhì)中，以1.0 mol/L間苯二酚為顯色劑，測得硝酸鹽在0～30 μg/25 mL、亞硝酸鹽在0～25 μg/25 mL范圍內(nèi)，符合比耳定律；摩爾吸收系數(shù)分別為0.8×103、4.0×103L/（mol·cm），參比波長分別為545、405 nm，補(bǔ)償系數(shù)分別為0.934 5、0.980 2。對上述菠菜、生菜、芹菜試樣分別進(jìn)行7 次測定，得到相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.25%、4.38%、3.11%；回收率分別為95.2%、98.5%、93.7%，說明采用此方法測定蔬菜中的硝酸鹽和亞硝酸鹽具有準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。

采用不同的光譜法測定蔬菜中的硝酸鹽和亞硝酸鹽具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)（表6），在實(shí)際操作過程中要根據(jù)不同的要求與條件來選擇合適的方法。例如，如果對準(zhǔn)確度和精確度沒有特殊的要求，可以采用格里斯分光光度法與苯酚分光光度法。如果對結(jié)果的準(zhǔn)確度和精確度要求比較高，在實(shí)驗(yàn)室條件允許的情況下，可以采用紫外分光光度法測定蔬菜中的硝酸鹽與亞硝酸鹽。

表 6 不同光譜法測定硝酸鹽和亞硝酸鹽的比較[33-41]Table 6 Comparison of different spectroscopic methods to analyze nitrite and nitrate contents[33-41]

3.2 色譜法

色譜法檢測蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的常用方法為高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、離子色譜 （ion chromatography，IC）法和氣相色譜（gas chromatography，GC）法。高效液相色譜儀具有很高的精確度與靈敏度，可以進(jìn)行批量測定，樣品經(jīng)過預(yù)處理，過濾膜后就可以直接進(jìn)行HPLC測定，并且10 min左右就能完成一個(gè)樣品的測定，因此采用HPLC同步測定的方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度和精密度高的優(yōu)點(diǎn)，能滿足蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量同步測定的要求，缺點(diǎn)是所用試劑有毒，對實(shí)驗(yàn)人員與環(huán)境有危害[42]。

GC的分離原理是利用不同物質(zhì)在兩相間具有不同的分配系數(shù)，將各組分分離開來，具有操作簡便、抗干擾能力強(qiáng)、線性范圍寬、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)[49]。史東坡[50]采用GC測定大白菜、馬鈴薯、西紅柿等蔬菜中的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，樣品經(jīng)前處理后，用硫酸作催化劑，溫度控制在90 ℃以下，此時(shí)樣品中的硝酸根可與苯發(fā)生反應(yīng)生成硝基苯，然后萃取，最后利用選擇性強(qiáng)的電子捕獲檢測器檢測。結(jié)果顯示：硝酸鹽的回收率在79.72%～101.79%之間，亞硝酸鹽的回收率在88.06%～105.81%；變異系數(shù)在3.22～5.93；硝酸鹽最低檢出限為0.75 mg/kg；亞硝酸鹽的最低檢測水平為0.609 mg/kg，說明采用GC測定蔬菜中的硝酸鹽與亞硝酸鹽具有分離性能與檢測性能高、結(jié)果準(zhǔn)確、精確度高等優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，采用色譜法測定蔬菜中硝酸鹽與亞硝酸鹽具有簡便、快速、精確度高等優(yōu)點(diǎn)，不同的方法具有不同的特點(diǎn)（表7），使得蔬菜中硝酸鹽與亞硝酸鹽含量的測定方法有了更多的選擇。

表 7 不同色譜法測定硝酸鹽和亞硝酸鹽的比較[43,46,49]Table 7 Comparison of different chromatographic methods to analyze nitrite and nitrate contents[43,46,49]

3.3 電化學(xué)法

電化學(xué)法是分析化學(xué)中的一個(gè)重要分支，它可以通過簡單的電位測量，直接測定溶液中某一種離子的活度，測定所用的設(shè)備簡單，而且能進(jìn)行連續(xù)快速的測定。目前用于測定蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的電化學(xué)方法主要有極譜法、硝酸根電極法和毛細(xì)管電泳法等[22]。

極譜法是通過測定電解過程中所得到的極化電極的電流-電位曲線來確定溶液中被測物質(zhì)濃度的一類電化學(xué)分析方法[51]。Badea等[51]采用醋酸纖維素膜或聚（1,8-二氨基萘）膜改性的鉑電極，快速批量的測定水中的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，與標(biāo)準(zhǔn)比色法相比，該方法不需要致癌試劑與任何檢測試劑，檢測方法簡單、快速。另外，這個(gè)方法可以擴(kuò)展到食物、土壤和化肥中的硝酸鹽和亞硝酸鹽的分析。

硝酸根電極法的原理為依據(jù)待測液在添加標(biāo)準(zhǔn)溶液前后的2次電位（E1和E2）不同，計(jì)算出待測液中硝酸根的濃度。此法精確度高、重現(xiàn)性好、操作簡便、抗干擾能力強(qiáng)，能快速準(zhǔn)確地完成大批樣品檢測，提高分析工作效率。姚建武等[52]采用此法快速測定白菜、生菜、茼蒿等蔬菜中的硝酸鹽含量，測定的回收率在99.5%～103%之間，變異系數(shù)在1.7%左右,表明該方法準(zhǔn)確、回收率高。

毛細(xì)管電泳法是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法[53]。ztekin等[53]采用毛細(xì)管電泳法直接測定肉制品和蔬菜中的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，該方法基于陰離子在涂有聚乙烯亞胺（polyethylene imine，PEI）的毛細(xì)管中的分離，由于PEI是陽離子聚合物，電流可以在寬范圍pH值中逆流，從而使硝酸鹽與亞硝酸鹽快速分離，不需要向分離器中加入其他任何的電流調(diào)節(jié)器，采用紫外檢測器檢測，硫氰酸鹽為內(nèi)標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的重現(xiàn)性和回收率良好。Merusi等[54]建立毛細(xì)電泳法同時(shí)測定硝酸根、亞硝酸根和草酸根的新方法，采用熔融石英毛細(xì)管柱（75 m×32.5 cm，有效長度為21.5 cm）作為分離通道，以50 mol/L磷酸鹽（pH 2.5）作為運(yùn)行緩沖液，運(yùn)行電壓25 kV，毛細(xì)管柱溫為25 ℃，檢測波長為214 nm，進(jìn)樣壓力為3.5 kPa，外標(biāo)法定量測定，結(jié)果表明硝酸鹽、亞硝酸鹽和草酸鹽的檢出限分別為0.3、0.8 mg/L和4.5 mg/L，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、檢出限低、重現(xiàn)性好。

綜上所述，采用電化學(xué)法測定硝酸鹽與亞硝酸鹽具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。每種方法都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)（表8），以后會被應(yīng)用到更廣泛的領(lǐng)域中。

表 8 不同電化學(xué)法測定硝酸鹽和亞硝酸鹽的比較Table 8 Comparison of different electrochemical methods to analyze nitrite and nitrate contents

3.4 快速檢測法

以上方法雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但是檢測過程都需要專業(yè)人員與儀器，操作較繁瑣、費(fèi)用高，檢測有一定的局限性。隨著食品安全問題的日益嚴(yán)峻，如何快速、簡便檢測出蔬菜中硝酸鹽、亞硝酸鹽的含量對人們的健康生活有非常重要的意義，現(xiàn)場快速檢測為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)提供了可能，因而越來越受到重視。一般認(rèn)為，如果方法能夠應(yīng)用于現(xiàn)場，在30 min內(nèi)出具檢測結(jié)果，即可視為現(xiàn)場快速檢測方法[55]。目前來看，現(xiàn)場快速檢測方法主要是根據(jù)亞硝酸鹽與顯色劑的顯色反應(yīng)來測定亞硝酸鹽的含量，一般采用試紙、試劑盒等形式。

肖良品等[56]研制出了三維紙質(zhì)微流控芯片用于亞硝酸鹽的快速檢測。紙質(zhì)微流控芯片是以紙作為芯片的一種微流控芯片。紙芯片系統(tǒng)內(nèi)的疏水材料把親水性的紙材料分割成親水與疏水相間的區(qū)域，形成通道，并集成了進(jìn)樣、分離、反應(yīng)、檢測等基本操作單元。紙芯片中以檸檬酸、對氨基苯磺酰胺、N-（1-萘基）乙二胺鹽酸作為顯色劑，結(jié)合比色檢測裝置用于亞硝酸鹽的檢測。亞硝酸鹽檢測紙芯片應(yīng)用簡單，耗樣量少（30 L），成本低，靈敏度較好，能快速實(shí)現(xiàn)亞硝酸鹽的檢測，為亞硝酸鹽的快速檢測方法提供了參考。

房彥軍等[57]利用檢測試紙條和光電檢測儀聯(lián)用的方法，通過檢測試紙與亞硝酸鹽顯色反應(yīng)的原理，將顯色的試紙條在光電檢測儀的感應(yīng)窗里測定，實(shí)現(xiàn)了對食品中亞硝酸鹽的現(xiàn)場快速定量檢測。屈智慧等[58]采用定性中速濾紙作為亞硝酸根試紙的材料，以含有4-氨基苯磺酰胺和N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽的顯色劑及含有1∶1的α-萘胺溶液和對氨基苯磺酸溶液的顯色劑，按1∶1混合后作為顯色劑，研制了一種檢測亞硝酸根的試紙。李健等[59]根據(jù)顯色劑顯色反應(yīng)測吸光度的原理研制出一種可以快速、簡便、靈敏、安全的針對亞硝酸鹽國際限量（4 mg/kg）和硝酸鹽國際限量（432 mg/kg）的兩種試劑盒，用于檢測蔬菜中硝酸鹽與亞硝酸鹽含量，可以滿足現(xiàn)場快速檢測的需要，具有實(shí)用價(jià)值。通過這些應(yīng)用實(shí)驗(yàn)表明，亞硝酸根試紙、試劑盒具有體積小、便于攜帶、檢測方便、成本低廉等特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和市場開發(fā)前景。

4 展 望

綜上所述，蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的檢測方法有多種，各種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，在選擇方法的時(shí)候要根據(jù)具體情況選擇合適的方法進(jìn)行測定。分光光度法方法簡單、快速，選擇性好，所用試劑穩(wěn)定，毒性相對較小。格里斯分光光度法是經(jīng)典的方法，該方法回收率高，重現(xiàn)性好，操作簡便，適應(yīng)于批量測定。色譜法快速、準(zhǔn)確，靈敏度和精密度高，需要相應(yīng)的儀器，但是不適于現(xiàn)場速檢，所用試劑有毒。快速檢測方法簡便、快速，不需要專業(yè)人員操作，所用試劑對環(huán)境沒有危害，能滿足現(xiàn)場檢測的需要，具有十分廣泛的前景。目前我國現(xiàn)場快速檢測技術(shù)發(fā)展還不夠完善，與發(fā)達(dá)國家還存在一定的差距，隨著現(xiàn)代化學(xué)分析、生物技術(shù)方法的不斷成熟完善，將來可以將光譜法、色譜法等這些技術(shù)加入為現(xiàn)場快速檢測中，使大型儀器微型化，安裝在專門檢測車中進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測。

科技的迅猛發(fā)展，會創(chuàng)造出更多的方法適用于檢測蔬菜中硝酸鹽與亞硝酸鹽的含量。目前，生物傳感器法和連續(xù)自動(dòng)分析儀法是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

生物傳感器是基于傳感器對生物物質(zhì)敏感，經(jīng)分子識別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的信息繼而被相應(yīng)的物理或化學(xué)換能器轉(zhuǎn)變成可定量和可處理的電信號，再經(jīng)二次儀表放大并輸出，便可知道待測物濃度。由于酶膜、線粒體電子傳遞系統(tǒng)粒子膜、微生物膜、抗原膜、抗體膜對生物物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)具有選擇性識別功能，只對特定反應(yīng)起催化活化作用，因此生物傳感器具有非常高的選擇性，具有分析速度快、準(zhǔn)確度高、系統(tǒng)操作比較簡單、成本低等優(yōu)勢，其缺點(diǎn)是生物固化膜不穩(wěn)定。

連續(xù)自動(dòng)分析儀法是將生化分析中的取樣、加試劑、混合、保溫、比色、結(jié)果計(jì)算、書寫報(bào)告等步驟的部分或全部由模仿手工操作的儀器來完成，可進(jìn)行定時(shí)、連續(xù)檢測等各種反應(yīng)類型的分析測定，具有檢測快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但是應(yīng)用有一定的局限性。

由于生物傳感器法和連續(xù)自動(dòng)分析儀法都具有簡便、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，將來可以將其應(yīng)用到蔬菜中硝酸鹽與亞硝酸鹽的檢測中，使檢測更方便、快捷。

隨著分析新方法和新技術(shù)的不斷出現(xiàn)和發(fā)展，蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的檢測方法也會更加多元化?？梢灶A(yù)見，現(xiàn)代儀器自動(dòng)化和測試技術(shù)的發(fā)展、普及和完善，必將使蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的分析研究更加完善，對蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的分析研究也將會更加深入，極低含量的檢測成為必然趨勢，而且測定方法必將趨于更加簡單、快捷、靈敏和高效。

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