秦明鳴，魏江華，俞曉麗，張景龍，劉曉鵬，馬曉玲，王華巖 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西省干細胞工程技術研究中心，陜西 楊凌 700 陜西萬盛肉類加工有限公司，陜西 楊凌 700

豬bmp15基因報告載體的構建及其特異性

秦明鳴1，魏江華2，俞曉麗1，張景龍1，劉曉鵬1，馬曉玲1，王華巖1
1 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西省干細胞工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100 2 陜西萬盛肉類加工有限公司，陜西 楊凌 712100

為了研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白15 (bmp15) 基因的表達和調(diào)控特性，通過克隆豬bmp15基因2.2 kb啟動子片段，構建pBMP15-EGFP報告載體，實現(xiàn)監(jiān)測干細胞向類卵母細胞分化的過程。以豬卵巢組織和中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)、成肌細胞 (C2C12)、豬羊水干細胞 (pAFSC) 為材料，通過RT-PCR、免疫熒光、細胞轉染、顯微注射檢測bmp15組織特異性表達，并且通過單層細胞誘導檢測該基因體外示蹤類卵母細胞獲得過程的能力。RT-PCR結果顯示bmp15在豬的卵巢組織中特異表達，在CHO中表達，而在C2C12和pAFSC中不表達。卵巢組織切片免疫熒光檢測結果顯示bmp15表達于卵泡發(fā)育的各個階段。瞬時轉染不同細胞發(fā)現(xiàn)啟動子只在CHO中有活性，而在C2C12和pAFSC中均無活性。顯微注射重組質(zhì)粒片段結果顯示增強綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorecence Protein，EGFP) 在卵母細胞體外成熟18 h啟動表達，并能夠持續(xù)至4-細胞期胚胎。單層細胞誘導結果顯示誘導12 d的pAFSC出現(xiàn)攜帶EGFP的圓形細胞團。說明bmp15具有表達特異性和示蹤干細胞誘導分化為類卵母細胞的潛能。

豬，bmp15，啟動子，基因表達，豬羊水干細胞

骨形態(tài)發(fā)生蛋白15 (Bone morphogenetic protein 15，Bmp15) 是一種自分泌生長因子，與生長分化因子9 (Grow differential factor 9，Gdf9) 同屬于TGFβ家族成員，在早期卵泡的生長發(fā)育及排卵過程中起重要作用[1]。bmp15與gdf9都是卵母細胞發(fā)育的特異性基因，它們之間具有高度相似的結構[2]，都在卵母細胞成熟和受精過程中發(fā)揮重要的作用[3]。Bmp15與顆粒細胞上BMPRII型受體結合，使促卵泡雌激素(Follicle-stimulating hormone, FSH) 受體表達下調(diào)，因此抑制了依賴FSH的StAR、P450scc等基因的表達，顯示了抑制黃體化的作用[4]。對Bmp15的相關研究能夠使研究者更好地理解生殖細胞發(fā)生發(fā)育分化過程的分子機制，為體外誘導胚胎干細胞 (Embroyonic stem cell, ESC) 和誘導多能干細胞 (Induced pluripotent stem cell, iPSC) 向生殖細胞誘導分化提供了理論基礎。

目前，用ESC、iPSC和成體干細胞 (Adult stem cell, ASC) 誘導原始生殖細胞的研究取得了一定進展[5-8]，誘導的卵母細胞已具有獲得成活的小鼠后代的能力[9]。為了示蹤并驗證不同時期雌性生殖細胞的產(chǎn)生，一系列與生殖細胞相關的EGFP啟動子報告載體被構建出來，其中有Oct4-EGFP[8]、Gdf9-EGFP[10]、Dazl-EGFP[11]和Figlα-EGFP[12]等。因此，利用bmp15基因的EGFP啟動子報告載體可作為體外獲取卵母細胞的潛在標記。

羊水干細胞是存在于胎兒羊水中的多能性干細胞，來源于胎兒組織[13]。這些細胞呈Oct4陽性，同時表達部分成體干細胞標記，具有強大的增殖能力和向三胚層分化的潛能[14]，可在體外分化為脂肪細胞[15]、跳動樣心肌細胞等[16]，是一種具有重要研究價值的新型干細胞。本研究通過檢測bmp15的組織表達特異性、構建啟動子報告載體、細胞轉染、顯微注射等技術手段，檢測重組質(zhì)粒的活性，并用于誘導豬羊水干細胞向類卵母細胞分化過程的示蹤。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR Primer Sequences

1 材料與方法

1.1 菌種、載體及細胞

大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒pEGFP-1、pEGFP-C1，中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)、小鼠成肌細胞(C2C12)、豬羊水干細胞 (Porcine amniotic fluid stem cell，pAFSC) 由陜西省干細胞工程技術研究中心保存。豬卵母細胞 (Porcine oocyte，pO)采集于陜西萬盛肉類加工有限公司的屠宰場。pGEM-T Easy載體購自Promega公司。

1.2 試劑及耗材

總RNA提取試劑盒、基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、多聚賴氨酸處理載玻片等常規(guī)試劑，均購自天根公司；DNA marker購自BioLabs公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、反轉錄試劑盒和Taq聚合酶均購自Fermentas 公司；Opti-MEM、α-MEM、DMEM和M199培養(yǎng)基均購自Invitrogen 公司；FSH、孕馬血清促性腺激素 (PMSG)、人絨毛膜促性腺激素 (HCG) 均購自寧波第二激素廠；非必需氨基酸 (NEAA)、L-谷氨酰胺 (L-Glu)、β-巰基乙醇 (β-ME)、陽離子脂質(zhì)體 (Lipofectamine 2000)、胎牛血清 (FBS)、表皮生長因子 (EGF)購自Gibco公司；兔抗Bmp15抗體和羊抗兔Cy3二抗均購自Abcam 公司；PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 RT-PCR檢測bmp15在成年豬組織和幾種細胞系中的表達特異性

從成年豬卵巢、睪丸、胃、肝臟、肌肉、腎臟、心臟、胸腺、肺臟組織中提取總RNA，同時提取CHO、C2C12、pAFSC和pO的總RNA；反轉錄為cDNA，用RT-PCR方法檢測bmp15在成年豬組織和幾種細胞系中的表達特異性 (表1)。

1.4 免疫組織化學法定位豬卵巢組織內(nèi)Bmp15表達

取成年豬卵巢組織，用4%多聚甲醛固定并用石蠟包埋，常規(guī)方法制作2 μm石蠟切片。將石蠟切片貼附于多聚賴氨酸處理過的載玻片上。經(jīng)60 ℃烘片5–6 h，進行免疫熒光染色：切片以二甲苯脫蠟及梯度酒精復水；用0.01 mol/L 枸櫞酸鈉緩沖液加熱至沸騰進行抗原修復；以5% BSA室溫封閉30 min；加入兔抗Bmp15抗體4 ℃過夜；PBS pH 7.2–7.4，洗片5 min，重復洗3次加稀釋的羊抗兔Cy3二抗工作液，37 ℃孵育30 min；PBS 洗片5 min，重復洗3次加入DAPI染核1 min；PBS 洗片5 min，重復洗3次通過水洗、脫水、透明、中性樹膠封片，在熒光顯微鏡下觀察照相。

1.5 豬bmp15啟動子片段的分子克隆及報告載體的構建

從豬卵巢組織提取基因組DNA，在豬的bmp15基因序列 (GenBank Accesion No. 448811) 的上游區(qū)域設計啟動子引物，在設計好的引物上游加入XhoⅠ酶切位點，下游加入Hind Ⅲ酶切位點 (表1)?？寺￠L度為2.2 kb (-2 166～+0)的bmp15啟動子片段。產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，并與pGEM-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌DH5α中。挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序。測序正確的質(zhì)粒與pEGFP-1使用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和Hind Ⅲ酶切，膠回收連接后轉化，挑取單克隆菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SacⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pBMP15-EGFP。

1.6 豬bmp15啟動子在不同細胞系中的表達活性檢測

將陽性對照pEGFP-C1和構建好的pBMP15-EGFP報告載體通過脂質(zhì)體轉染法轉染培養(yǎng)于24孔板培養(yǎng)皿中的CHO、C2C12、pAFSC。轉染前1 d對細胞進行傳代，當細胞密度達到80%時即可進行轉染。轉染前2 h加入0.5 mL含5%血清的培養(yǎng)液對細胞進行饑餓處理。取0.8 μg pBMP15-EGFP和50 μL無血清的稀釋液Opti-MEM混合，2 μL脂質(zhì)體與50 μL Opti-MEM混合；5 min后，將上述兩種混合物混合 (總體積100 μL)，輕輕混合均勻，在室溫下孵育25 min，加入含有適量新鮮培養(yǎng)液的細胞中；放入37 CO℃2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4–6 h后更換含10% 血清的新鮮培養(yǎng)液；轉染24 h后用熒光顯微鏡觀察。

1.7 豬bmp15啟動子在卵母細胞中的表達活性檢測

從屠宰場收集豬卵巢，32–38 ℃保存在含有青霉素和鏈霉素的生理鹽水中，2 h內(nèi)運回實驗室。用抽吸法采集卵巢卵母細胞，用含青霉素和鏈霉素的生理鹽水沖洗卵巢3–5次，然后抽取3–6 mm卵泡中的豬卵泡液 (Porcine follicle fluid, pFF) 置于離心管中，37 ℃水浴靜置數(shù)分鐘，待卵子沉降后，收取豬卵泡液，離心過濾備用。將卵母細胞用洗卵液洗兩遍，實體顯微鏡下挑取胞質(zhì)均勻、顆粒細胞層達兩層以上的顆粒細胞-卵母細胞復合物 (Cumulus oocyte complex，COC)，COC分別在預熱的洗卵液和成熟培養(yǎng)液中各洗3次，之后在培養(yǎng)箱中孵育2 h，取出用0.3%透明質(zhì)酸酶溶液脫去顆粒細胞。將重組質(zhì)粒用XhoⅠ和NotⅠ酶切，獲得pBMP15-EGFP啟動子報告基因片段，通過膠回收純化處理后注射入脫顆粒的卵母細胞中，于18 h時觀察卵母細胞綠色熒光的表達情況。之后孤雌激活的卵母細胞轉入胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2–3 d后觀察卵裂情況，用熒光顯微鏡觀察卵裂細胞綠色熒光的表達。

1.8 豬bmp15啟動子在重編程細胞中的檢測

將P10–P15代的pAFSC接種至12孔培養(yǎng)板中，在38 ℃、5% CO2條件下用羊水干細胞培養(yǎng)液 (α-MEM+ 10% FBS+ 2 mmol/L L-Glu+ 100 U/mL青霉素+ 100 U/mL鏈霉素) 培養(yǎng)。待細胞密度達到60%–70%匯合度時，用胰酶消化后，將細胞接種至60 mm細胞培養(yǎng)皿中。待細胞貼壁后，將培養(yǎng)液換為羊水干細胞誘導液(α-MEM+ 5% pFF+ 5% FBS+ 1 mmol/L NEAA+ 1% β-ME+ 1 mmol/L L-Glu+ 1.5 μmol/L EGF)。此時記為0 d，隔天換液，培養(yǎng)12 d，觀察誘導細胞的形態(tài)變化并對瞬時轉染pBMP15-EGFP質(zhì)粒的細胞綠色熒光進行觀察。

2 結果

2.1 豬bmp15組織和細胞表達特異性及內(nèi)源Bmp15在卵巢組織中的定位

采用RT-PCR方法對豬的卵巢、睪丸、胃、肝臟、肌肉、腎臟、心臟、胸腺、肺臟等9種組織進行了檢測，結果顯示，bmp15具有組織表達特異性，只在卵巢組織中高表達，而在其他組織中低表達或不表達 (圖1A)。對不同來源的細胞進行RT-PCR檢測結果顯示，在豬卵母細胞以及CHO中表達，而在C2C12和pAFSC中不表達，顯示了bmp15在不同細胞中的表達特異性 (圖1B)。

通過免疫熒光方法對豬卵巢組織進行檢測，結果顯示，與未加一抗的陰性對照組 (圖2D) 相比，初級卵泡 (圖2A)、次級卵泡 (圖2B)和成熟卵泡 (圖2C) 中均可觀察到bmp15陽性細胞的存在，說明Bmp15蛋白表達。這一結果顯示Bmp15存在于卵泡發(fā)育的各個階段。

2.2 豬bmp15啟動子片段的克隆及pBMP15-EGFP重組質(zhì)粒的篩選和鑒定

以豬卵巢組織提取的基因組為模板，經(jīng)PCR擴增得到約2.2 kb的片段 (圖3A)。DNA片段測序結果通過BLAST比對表明，克隆序列與預期片段相同，說明克隆的片段為豬bmp15序列的上游啟動子片段。將此啟動子片段上傳NCBI獲得GenBank登錄號為KF114861。與報告載體pEGFP-1連接的重組質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切酶SacⅠ和Hind Ⅲ雙酶切獲得1 kb和5.3 kb兩個片段，結果與預期相符 (圖3B)，說明重組報告載體構建成功，命名為pBMP15-EGFP (圖3C)。

圖1 骨形成蛋白15在豬不同組織和細胞系中的表達Fig. 1 RT-PCR analysis of bmp15 expression in porcine tissues and different cells. (A) Nine porcine tissues. 1-9: ovary, testis, stomach, liver, muscle, kidney, heart, thymus and lung. (B) 1-4: pO, CHO, pAFSC and C2C12.

圖2 免疫熒光檢測Bmp15在豬卵巢組織中的表達Fig. 2 Immunofluorescence assay of Bmp15 expression in porcine ovary. (A) Primary follicle. (B) Secondary follicle. (C) Matured follicle. (D) Negative control without primary antibody. 1: Bmp15 staining; 2: nucleus staining with DAPI; 3: the merged images.

圖3 bmp15啟動子片段克隆及報告載體構建Fig. 3 Subclone and construction of bmp15 reporter vector. (A) PCR product of bmp15 promoter. (B) SacⅠand Hind Ⅲ digestion of the recombinant plasmid. M: DNA marker. (C) The recombinant plasmid.

2.3 pBMP15-EGFP在不同細胞系和卵母細胞中的活性檢測

將重組載體pBMP15-EGFP及陽性對照載體pEGFP-C1分別轉染CHO、C2C12、pAFSC等細胞中，24 h后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)轉染重組載體及陽性對照載體的CHO細胞均有表達EGFP陽性細胞的存在 (圖4A、4D)。在C2C12和pAFSC中，轉染pEGFP-C1的細胞均能檢測到EGFP的表達 (圖4B、4C)，而轉染重組質(zhì)粒的細胞均未觀察到EGFP陽性細胞的存在 (圖4E、4F)。這說明bmp15啟動子在CHO中有活性，而在成肌細胞和豬羊水干細胞中沒有活性。

為了進一步驗證啟動子片段在卵母細胞中的活性，將XhoⅠ和NotⅠ雙酶切獲得BMP15-EGFP片段，顯微注射入去顆粒細胞的GV期卵母細胞中。結果顯示，在卵母細胞體外成熟至18 h時，綠色熒光出現(xiàn)在大多數(shù)卵母細胞中 (圖5A)。將注射有DNA片段的卵母細胞進行體外激活，發(fā)育至2-4細胞時仍可以檢測到微弱的綠色熒光，說明Bmp15在卵母細胞體外成熟過程中發(fā)揮功能作用 (圖5B、5C)。在未注射BMP15-EGFP片段的GV期豬卵母細胞(圖5D)、2-細胞期胚胎 (圖5E) 和4-細胞期胚胎 (圖5F) 中，均未檢測到綠色熒光蛋白的表達。

圖4 pBMP15-EGFP重組質(zhì)粒在不同細胞中的表達檢測Fig. 4 Identification of bmp15 promoter activity in different cell lines after the transient transfection. (A) CHO cells with pEGFP-C1. (B) pAFSC with pEGFP-C1. (C) C2C12 cells with pEGFP-C1. (D) CHO cells with pBMP15-EGFP. (E) pAFSC with pBMP15-EGFP. (F) C2C12 cells with pBMP15-EGFP. 1: light images; 2: fluorescence images.

圖5 BMP15-EGFP片段顯微注射入豬卵母細胞Fig. 5 Microinjection of the BMP15-EGFP DNA fragment into porcine oocyte. (A) BMP15-EGFP in matured oocytes in vitro for 18 h. (B) BMP15-EGFP in 2-cell embryos. (C) BMP15-EGFP in 4-cell embryos. (D) Negative control in matured oocytes in vitro for 18 h. (E) Negative control in 2-cell embryos. (F) Negative control in 4-cell embryos. 1: light images; 2: fluorescence images.

2.4 pBMP15-EGFP重組質(zhì)粒在pAFSC誘導分化過程中的示蹤作用

羊水干細胞在誘導液中培養(yǎng)，使其向類卵母細胞轉分化。為了示蹤分化過程，將pBMP15-EGFP瞬時轉染入誘導的類卵母細胞中，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白。結果顯示，經(jīng)過誘導的豬羊水干細胞在誘導過程中細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞形態(tài)由原來的成纖維樣轉變?yōu)閳A形。誘導12 d，可見培養(yǎng)皿中存在大量的圓形細胞團，直徑在40–60 μm左右(圖6A)，綠色熒光在圓形細胞團中表達 (圖6B)，團塊中存在可見多個細胞核 (圖6C)，呈現(xiàn)出類似卵母細胞的細胞結構。

圖6 pBMP15-EGFP示蹤pAFSC誘導分化Fig. 6 pBMP15-EGFP monitoring the differentiation of pAFSC into OLCs after 12 days induction. (A) The OLCs. (B) The GFP expression after transient transfect pBMP15-EGFP into OLCs. (C) DAPI staining. (D) The merge image.

3 討論

Bmp15和Gdf9具有相似的結構，同屬于TGFβ家族成員。但是，與其他TGFβ超家族成員不同的是，Bmp15和Gdf9均缺乏保守序列中7個半胱氨酸中的第4個半胱氨酸殘基，而該半胱氨酸與蛋白質(zhì)的二硫鍵形成有關，因此它們通常以單體、異源二聚體或同源二聚體等形式發(fā)揮作用[18]。豬bmp15在組織中的表達分布主要集中在卵母細胞中，而gdf9除在卵母細胞中表達外，也可以在豬的其他組織中檢測到。顯然，bmp15的組織特異性更強，這可能與豬的bmp15基因定位于X染色體上有某種關系[19]。

CHO細胞系是中國倉鼠卵巢上皮細胞，可單層貼壁培養(yǎng)，具有卵巢組織的特異性，因此作為陽性參照細胞。C2C12是小鼠成肌細胞，作為陰性參照細胞，而作為實驗組的pAFSC，則驗證bmp15啟動子是否具有在該細胞內(nèi)工作的能力。結果顯示，此啟動子不能在C2C12和pAFSC工作，這與預期相符。綠色熒光蛋白僅在CHO中有表達，可能因為種屬差異造成表達量較低。為了進一步驗證啟動子的工作能力，顯微注射BMP15-EGFP片段至體外成熟的卵母細胞中，發(fā)現(xiàn)成熟18 h時可見明顯綠色熒光，這與Li等實驗結果相符。他們檢測到Bmp15在體外成熟18 h的豬卵母細胞中表達量達到峰值，之后表達量逐漸減弱[17]。體外成熟至2–4細胞期的孤雌胚胎，綠色熒光蛋白的表達也隨著胚胎發(fā)育而減弱。豬卵母細胞體內(nèi)發(fā)育過程轉錄組數(shù)據(jù)也顯示，豬Bmp15在卵母細胞時期的表達量要高于胚胎期的表達量 (數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

之前的實驗證明，小鼠胚胎干細胞在體外先分化為原始生殖細胞，之后通過誘導產(chǎn)生類卵母細胞[20]。這一分化潛能通過減數(shù)分裂相關基因的檢測而進一步加以證明[21]。除此之外，豬的皮膚干細胞在卵泡液誘導下也能生出具有卵母細胞樣結構的細胞，人的羊水干細胞也具有向卵母細胞誘導分化的潛能，并在此過程中bmp15基因被激活[22]。這些都為bmp15作為生殖細胞標記提供了基礎。通過誘導豬羊水干細胞，發(fā)現(xiàn)瞬時轉染誘導12 d的細胞表達綠色熒光蛋白，同時細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，進一步驗證了bmp15啟動子作為報告載體的可行性。

本實驗證明了bmp15在豬不同組織中的表達特異性，并構建了pBMP15-EGFP報告載體，驗證在不同成體細胞和豬卵母細胞中的表達能力，成功構建了可追蹤體外誘導生殖細胞的報告載體，為開展干細胞體外向卵母細胞誘導分化奠定了基礎。

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(本文責編 陳宏宇)

Construction and specificity of porcine bmp15 gene reporter vector

Mingming Qin1, Jianghua Wei2, Xiaoli Yu1, Jinglong Zhang1, Xiaopeng Liu1, Xiaoling Ma1, and Huayan Wang1
1 College of Veterinary Medicine, Shaanxi Center of Stem Cells Engineering and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China 2 Shaanxi Wansheng Meat Processing Co., Ltd., Yangling 712100, Shaanxi, China

The aim of this study is to identify the express specificity of bone morphogenetic protein 15 (Bmp15) in porcine. The pBMP15-EGFP reporter vector was constructed from the 2.2 kb fragment of porcine bmp15 promoter to trace the differentiation process of stem cells into oocyte-like cells. We used porcine ovary and Chinese Hamster Ovary cell line (CHO), mouse myoblast cell line (C2C12) and porcine amniotic fluid stem cell (pAFSC) to investigate the expression and regulation of this gene via RT-PCR, immunofluorescence, cell transfection, and microinjection methods. We also used single layer cell differentiation to detect the application potential of bmp15. The results show that bmp15 gene was specifically expressed in the porcine ovary and CHO rather than in C2C12 and pAFSC. In addition, the characteristic of tissue-specific of Bmp15 was detected on CHO instead of other cell lines by transient transfection. We also detected the expression of Bmp15 in oocyte at different development stages by immunofluorescence of fixed paraffin-embedded ovary sections. Furthermore, microinjection results show that bmp15 expressed in oocytes at 18 h of maturation in vitro, and continued up to 4-cell stage embryos. Most importantly, we found that the expression of Bmp15 started at day 12 after inducing pAFSC into oocyte-like cells by transfection; green fluorescent was visible in round cell masses. It indicated that bmp15 has the expression specificity and the pBMP15-EGFP reporter vector can be used to trace Bmp15 action in the differentiation of stem cells into germ cells.

porcine, bone morphogenetic protein 15, promoter, gene expression, porcine amniotic fluid stem cell

May 4, 2013; Accepted: June 22, 2013

Huayan Wang. Tel: +86-29-87080069; E-mail: hhwang101@163.com

秦明鳴, 魏江華, 俞曉麗, 等. 豬bmp15基因報告載體的構建及其特異性. 生物工程學報, 2014, 30(2): 203-212.

Qin MM, Wei JH, Yu XL, et al. Construction and specificity of porcine bmp15 gene reporter vector. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 203-212.

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2009CB941002).

國家重點基礎研究發(fā)展計劃 (973 計劃) (No. 2009CB941002) 資助。

時間：2013-08-16 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20130816.1715.005.html