趙 光，馬 放，孫 婷，李樹(shù)本，游 空，趙 貞

基于高通量測(cè)序的寒地沼氣池微生物群落解析

趙 光1，2，馬 放1，2，孫 婷3，李樹(shù)本4，游 空4，趙 貞1，2

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150090哈爾濱；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，150090哈爾濱；3.遼寧工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，121001遼寧錦州；4.海林農(nóng)場(chǎng)，150000黑龍江牡丹江）

為實(shí)現(xiàn)寒地沼氣發(fā)酵系統(tǒng)高效、穩(wěn)定運(yùn)行，應(yīng)建立基于沼氣發(fā)酵微生物群落的復(fù)合調(diào)控策略.本研究耦合454高通量測(cè)序和PCR-DGGE分析方法，對(duì)北方規(guī)模最大的海林農(nóng)場(chǎng)沼氣池內(nèi)細(xì)菌及產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析.取沼氣池穩(wěn)定運(yùn)行期沼液樣品，分析系統(tǒng)內(nèi)微生物群落多樣性.結(jié)果顯示，共獲得1 297條高質(zhì)量微生物序列，在屬和種的分類水平上，至少存在581個(gè)細(xì)菌屬和666個(gè)細(xì)菌種.優(yōu)勢(shì)菌群有Firmicutes、Bacteroidetes及Proteobacteria，相對(duì)豐度分別為46.39%、21.41%和18.98%.優(yōu)勢(shì)屬（相對(duì)豐度＞5.0%）包括Proteiniphilum、Spirochaeta和Wolinella．DGGE分析結(jié)果表明，產(chǎn)甲烷古菌包括Methanocorpusculum sp.、Methanosaeta sp.、Methanobacterium sp.及Methanosarcina sp..，表明沼氣池的產(chǎn)甲烷途徑以乙酸代謝類型為主，水解、酸化過(guò)程主要由來(lái)自動(dòng)物消化系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌完成．

沼氣；微生物群落；海林農(nóng)場(chǎng)；牛糞；454焦磷酸測(cè)序技術(shù)

應(yīng)用厭氧生物技術(shù)處理農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)沼氣，可以作為石化能源的替代能源，而且對(duì)于改善農(nóng)村環(huán)境質(zhì)量、調(diào)整能源消費(fèi)結(jié)構(gòu)等均具有重要意義［1-2］.厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣是一系列復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，在有機(jī)物降解的不同階段都會(huì)由具有相應(yīng)功能的微生物作用.這些微生物的代謝過(guò)程相互抑制，同時(shí)相互依存，共同維系厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行［3］.有機(jī)物厭氧發(fā)酵的產(chǎn)甲烷過(guò)程中，非產(chǎn)甲烷菌群和產(chǎn)甲烷菌群既相互競(jìng)爭(zhēng)，又相互依存.水解、產(chǎn)酸菌群為產(chǎn)甲烷菌群提供產(chǎn)甲烷底物基質(zhì)，同時(shí)如果產(chǎn)酸代謝旺盛就會(huì)嚴(yán)重抑制產(chǎn)甲烷菌群的活性；產(chǎn)甲烷菌群也為水解、產(chǎn)酸菌群的正向代謝解除反饋抑制，并創(chuàng)造熱力學(xué)上的優(yōu)越條件.因此，調(diào)控厭氧消化系統(tǒng)內(nèi)兩大功能菌群的代謝平衡是獲得穩(wěn)定、高效產(chǎn)氣率的關(guān)鍵.深入解析厭氧發(fā)酵系統(tǒng)微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)，對(duì)于厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的升級(jí)改造及工藝優(yōu)化均有重要指導(dǎo)作用.近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者基于傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的微生物群落開(kāi)展了大量研究，也發(fā)現(xiàn)了一些典型的參與厭氧發(fā)酵過(guò)程的微生物［4-6］.但由于技術(shù)手段的局限性，無(wú)法對(duì)發(fā)酵過(guò)程微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面深層次的研究和解析.

高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各學(xué)科研究，拓寬了對(duì)于環(huán)境微生物研究的尺度與深度.目前，普遍應(yīng)用的大規(guī)模高通量測(cè)序平臺(tái)主要有Roche公司的454焦磷酸測(cè)序技術(shù)（454 pyrosequencing technology）、ABI公司的SOLiD（supported oligo ligation detetion）以及Illumina公司的Solexa等.此外，深入解析厭氧發(fā)酵系統(tǒng)運(yùn)行過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)演替及功能的改變，對(duì)于研究系統(tǒng)運(yùn)行不穩(wěn)定機(jī)理及制定有效調(diào)控策略，使其實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定運(yùn)行具有重要意義［7］.本研究以北方寒地最大的沼氣發(fā)酵系統(tǒng)——黑龍江海林農(nóng)場(chǎng)沼氣池為研究對(duì)象，耦合454焦磷酸高通量測(cè)序和PCR-DGGE分析技術(shù)，解析其穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)的微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成.以期為運(yùn)行工藝的優(yōu)化、系統(tǒng)升級(jí)改造、提高冬季甲烷轉(zhuǎn)化效率以及制定高效的調(diào)控策略提供理論參考.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 沼氣池發(fā)酵原料及運(yùn)行參數(shù)

海林農(nóng)場(chǎng)沼氣發(fā)酵系統(tǒng)生產(chǎn)模式如圖1所示，沼氣池總?cè)莘e1 920 m3，由8個(gè)分隔池體組成.發(fā)酵原料為牛糞，主要來(lái)自農(nóng)場(chǎng)圣澳奶牛養(yǎng)殖場(chǎng).沼氣池以半連續(xù)發(fā)酵工藝運(yùn)行，干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，發(fā)酵溫度為35℃，內(nèi)置機(jī)械攪拌系統(tǒng)，間歇式啟動(dòng)；有機(jī)負(fù)荷（organic loading rate，OLR）和水力停留時(shí)間（hydraulic retention time，HRT）分別為2 kg·m-3·d-1和50 d，日均沼氣產(chǎn)量1 200 m3.

圖1 海林農(nóng)場(chǎng)沼氣發(fā)酵系統(tǒng)生產(chǎn)模式

1.2 樣品采集

樣品采集于沼氣池產(chǎn)氣的穩(wěn)定運(yùn)行期，使用50 mL離心管于沼氣池出料口處收集，厭氧封存后轉(zhuǎn)移至冰盒，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃保存.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微生物群落結(jié)構(gòu)解析

樣品自然融化后，以500 r／min離心30 s，棄沉淀后待用.基因組DNA應(yīng)用Fast DNA SPIN Kit（Qbiogene Inc.）按照操作說(shuō)明提取.

1.3.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)解析

細(xì)菌16S rRNA V3高變區(qū)DNA擴(kuò)增采用通用引物對(duì)341f和534r.引物序列如表1所示，下劃線序列為454焦磷酸測(cè)序時(shí)區(qū)分各樣品所加7個(gè)堿基的唯一編碼序列標(biāo)記.PCR擴(kuò)增體系包括:模板DNA 50 ng，1X buffer，3 mmol／L MgCl2，每種引物10 pmol，0.4 mmol／L dNTP及1.25 U TaKaRa Ex Taq?HS.PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min.擴(kuò)增產(chǎn)物使用FLX 454 System測(cè)序，由國(guó)家人類基因組南方研究中心協(xié)助完成.

表1 16S rRNA細(xì)菌通用引物

所測(cè)得序列根據(jù)樣品唯一的tag標(biāo)記區(qū)分，使用RDP-II Classifier數(shù)據(jù)庫(kù)將序列進(jìn)行遺傳分類（從Genus到Phylum）［8］.相似矩陣（distance matrices）、聚類分析（cluster）、稀釋曲線（rarefaction curve）、Shannon-Weaver指數(shù)、覆蓋率（coverage estimator）、豐富度指數(shù)Chao1和ACE等應(yīng)用mothur software計(jì)算（http:／／www.mothur. org／wiki／Sogin-data-analysis）［9］.

1.3.3 產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)解析

產(chǎn)甲烷古菌V2-V3區(qū)擴(kuò)增使用通用引物對(duì)A109（T）-F和515GC-R［10］.PCR擴(kuò)增體系（50 μL）包括:模板DNA 100 ng，1X buffer，3 mmol／L MgCl2，20 pmol每種引物，0.4 mmol／L dNTP，1.25 U Taq DNA聚合酶.PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min.所有PCR反應(yīng)使用GeneAmp PCR System 9700完成（Applied Biosystems，CA，USA）.

DGGE應(yīng)用30%～50%的梯度膠，凝膠PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣后于60℃、75 V電泳16 h后銀染.將切膠后的條帶樣品回收、純化，PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化JM109，隨機(jī)挑取克隆，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子鑒定后測(cè)序.所得序列通過(guò)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTX功能進(jìn)行分析比對(duì).序列的線性及多重比對(duì)使用Clustal-X軟件完成，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)使用Mega 4.0以Neighbor-Joining算法構(gòu)建，自評(píng)1 000次［11］.

2 結(jié)果與討論

2.1 沼氣池細(xì)菌群落多樣性分析

為獲取更多沼氣池穩(wěn)定運(yùn)行期細(xì)菌群落多樣性信息，利用454高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V3高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，序列比對(duì)后分析種群多樣性和結(jié)構(gòu)組成.經(jīng)序列質(zhì)量篩選，去除堿基錯(cuò)配、缺失、含（N）序列及短序列等，獲得高質(zhì)量序列1 297條.

2.1.1 細(xì)菌多樣性評(píng)價(jià)

通量測(cè)序的數(shù)據(jù)分析一般將不同序列在同一相似水平下歸類于同一操作分類單元（operational taxonomic unite，OTU）.如表2所示，當(dāng)序列相似度為95%和97%時(shí)，分別產(chǎn)生581個(gè)和666個(gè)OTU，覆蓋率分別為66.8%和60.4%，說(shuō)明沼氣池穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)至少存在581個(gè)細(xì)菌屬和666個(gè)細(xì)菌種，細(xì)菌群落多樣性非常豐富.豐富度指數(shù)Chao1和ACE是反映物種群落豐欠狀況的指標(biāo)，本研究計(jì)算結(jié)果顯示，在屬分類水平沼液樣品Chao1和ACE分別為1 937和3 745.豐富度指數(shù)分析同樣表明，測(cè)序數(shù)量未能達(dá)到飽和，繼續(xù)擴(kuò)大測(cè)序通量仍可發(fā)現(xiàn)新的物種.

表2 細(xì)菌在不同分類水平的多樣性及豐富度指數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖2為沼液樣品細(xì)菌群落在不同分類水平下的稀釋曲線，取95%為置信區(qū)間，以每次隨機(jī)挑選10條序列進(jìn)行累加的方法計(jì)算.可以看出，起初隨著測(cè)序數(shù)量的增加，OTU數(shù)量迅速增加；隨著測(cè)序序列數(shù)量的進(jìn)一步增大，各分類水平下OTU數(shù)目的增加趨于平緩，但仍未達(dá)飽和.稀釋曲線的平滑程度越高，表明對(duì)環(huán)境樣品微生物的覆蓋率越高.

圖2 沼液樣品稀釋曲線

2.1.2 細(xì)菌群落組成的系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究從沼氣池沼液樣品中獲得1 297條高質(zhì)量有效微生物序列，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，序列相似度cutoff=0.3時(shí)的聚類分析，可產(chǎn)生666個(gè)OTU，即沼氣池中存在666個(gè)細(xì)菌種（species），相比傳統(tǒng)常用微生物研究的分子生物學(xué)手段，DGGE和克隆文庫(kù)技術(shù)體現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì).由于傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)基于Sanger測(cè)序法，一個(gè)宏基因組樣品聚類分析后獲得的OTU數(shù)小于50，極大阻礙了準(zhǔn)確了解群落結(jié)構(gòu)的組成.本研究在種的分類水平上，獲得的OTU數(shù)相比傳統(tǒng)技術(shù)增加了10倍以上，充分顯示出高通量測(cè)序技術(shù)的優(yōu)越性.

如圖3（a）所示，沼氣池沼液樣品細(xì)菌多樣性十分豐富，在門分類水平上屬于13個(gè)類群，主要包括:脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、揉膜菌門（Tenericutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、Synergistetes門、放線菌門（Actinobacteria）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、綠菌門（Chlorobi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、螺旋體門（Spirochaetes）和變形菌門（Proteobacteria）.優(yōu)勢(shì)類群為Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria，相對(duì)豐度分別占細(xì)菌群落的46.39%、21.41%和18.98%.處于次優(yōu)勢(shì)地位的類群為Spirochaetes和Fibrobacteres，相對(duì)豐度分別占細(xì)菌群落的8.27%和3.17%.

如圖3（b）所示，沼液樣品在綱分類水平屬于20個(gè)微生物類群，其中優(yōu)勢(shì)類群主要有（相對(duì)豐度＞2.0%）:梭菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、ε-變形菌綱（Epsilonproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、螺旋體綱（Spirochaetes）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、纖維桿菌綱（Fibrobacteria）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），相對(duì)豐度分別占細(xì)菌群落的36.60%、19.11%、11.52%、8.79%、8.70%、5.29%、3.50%和2.05%.

圖3 沼氣池細(xì)菌在門和綱分類水平的微生物組成

在屬分類水平，優(yōu)勢(shì)類群主要包括（相對(duì)豐度＞2.0%）:Proteiniphilumsp.（7.33%）、Spirochaeta sp.（6.78%）、Wolinella sp.（5.86%）、Coprococcussp.（4.16%）、Arcobacetrsp.（3.86%）、Fibrobactersp.（3.47%）、Tetrathiobacter sp.（2.93%）、Lysinibacillus sp.（2.47%）、Bacillus sp.（2.24%）和Bacteroides sp.（2.16%）（表3）.

表3 沼氣池樣品中相對(duì)豐度高于0.5%微生物OTU組成

2.2 沼氣池產(chǎn)甲烷古菌多樣性分析

為研究沼氣池穩(wěn)定運(yùn)行期產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)，提取沼液細(xì)菌基因組DNA，對(duì)產(chǎn)甲烷古菌16S rRNA V2-V3區(qū)PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳.DGGE圖譜如圖4所示，圖譜中包含12個(gè)優(yōu)勢(shì)條帶，對(duì)優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行DNA膠回收后，進(jìn)行基因克隆測(cè)序.由條帶的相對(duì)豐度可知，Band 2、Band 3和Band 12是最優(yōu)勢(shì)類群.系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，沼氣池產(chǎn)甲烷古菌主要分布在3個(gè)目，即甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）、甲烷微菌目（Methanomirobiales）和甲烷桿菌目（Methanobacteriales）.核酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，沼氣池產(chǎn)甲烷古菌包括Methanocorpusculum sp.、Methanosaetasp.、Methanobacteriumsp.及Methanosarcina sp.（表4）．其中，Methanosaeta sp.和Methanosarcina sp.是沼氣池內(nèi)最優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌．

圖4 沼氣池產(chǎn)甲烷古菌V2-V3區(qū)PCR產(chǎn)物DGGE圖譜

3 討 論

深入解析生物反應(yīng)器的微生物群落結(jié)構(gòu)，可揭示其在運(yùn)行過(guò)程中的運(yùn)行特征及已知的功能微生物群落結(jié)構(gòu)和未知群落之間存在的關(guān)系.應(yīng)用454焦磷酸高通量測(cè)序技術(shù)研究沼氣池穩(wěn)定運(yùn)行期沼液樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，得到了較高的覆蓋率，共獲得1 297條高質(zhì)量16S rRNA基因序列，覆蓋率在屬水平可達(dá)66.8%.相比傳統(tǒng)分子生物學(xué)手段獲得了更全面、準(zhǔn)確的微生物群落信息.其中最優(yōu)勢(shì)類群屬于Firmicutes（46.39%）、Bacteroidetes（21.41%）和Proteobacteria（18.98%），占序列總數(shù)的86%以上.在屬的水平上，優(yōu)勢(shì)類群包括Proteiniphilumsp.（7.33%）、Spirochaetasp.（6.78%）和Wolinella sp.（5.86%），均屬動(dòng)物消化系統(tǒng)內(nèi)常見(jiàn)微生物類群.由此可知，沼氣池有機(jī)底物水解、產(chǎn)酸過(guò)程的主要功能微生物來(lái)源于牛消化系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌類群，并未演替為具有較強(qiáng)有機(jī)物降解能力的Bacillus sp.、Clostridium sp.和Acinetobacter sp.等，以及揮發(fā)酸轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的Syntrophomonassp.、Ruminococcussp.和Desulfotomaculum sp.等微生物類群［12-14］.由于沼氣池采用的是單相混合發(fā)酵工藝運(yùn)行，揮發(fā)性脂肪酸的轉(zhuǎn)化速率仍是產(chǎn)甲烷效率的限速步驟.此外，以Proteiniphilum sp.、Spirochaeta sp.和Wolinella sp.為優(yōu)勢(shì)類群的群落結(jié)構(gòu)，影響了底物的降解和產(chǎn)酸速率，這也是造成沼氣池產(chǎn)氣量不高的主要原因之一.

很多研究證實(shí)，Bacteroidetes包括很多具有降解長(zhǎng)鏈脂肪酸功能的微生物類群，在降解長(zhǎng)鏈脂肪酸時(shí)具有重要作用［15］.一些長(zhǎng)鏈脂肪酸，如十二烷酸、油酸、辛酸和豆蔻酸等，尤其是十二烷酸是毒害作用最強(qiáng)的長(zhǎng)鏈脂肪酸.Wang等［16-17］在CSTR厭氧消化牛糞、牛糞與少量秸稈混合產(chǎn)甲烷過(guò)程中以及處理一些富含糖類物質(zhì)的廢棄物時(shí)發(fā)現(xiàn)Bacteroidetes為優(yōu)勢(shì)菌群.當(dāng)OLR增加時(shí)Clostridiaceae一類菌群增加，這表明系統(tǒng)內(nèi)微生物代謝由脂肪酸轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)底物的降解.Lee等［18］在應(yīng)用焦磷酸通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大規(guī)?；旌霞皟上喙に囍袦靥幚硎Ｓ辔勰喈a(chǎn)甲烷研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)種群為Proteobacteria（20.5%）、Bacteroidetes（19.7%）、Firmicutes（17.8%）和Chloroflexi（4.8%）.Godon等［19］研究應(yīng)用蒸酒廢物產(chǎn)甲烷時(shí)發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)勢(shì)類群屬Firmicutes，其次為Bacteroidetes和Proteobacteria.這一結(jié)論與本研究相似，Bacteroidetes在很多中溫發(fā)酵產(chǎn)甲烷系統(tǒng)中均為優(yōu)勢(shì)種群，表明與有機(jī)物降解的水解、酸化過(guò)程緊密相關(guān)［20］.

應(yīng)用PCR-DGGE對(duì)沼氣池產(chǎn)甲烷古菌多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷類群主要分布在Methanosarcinales、Methanomirobiales和Methanobacteriales.由條帶相對(duì)豐度可知，Methanosaeta sp．和Methanosarcina sp.是沼氣池內(nèi)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷古菌，均為乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌.由此可知，沼氣池以利用乙酸產(chǎn)甲烷途徑為主要代謝方式.利用H2及甲酸鹽為電子供體的Methanobacterium sp．和Methanocorpusculum sp.，在維持乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行中也具有重要作用.Rastogi等［21］研究夏季以牛糞為發(fā)酵底物產(chǎn)沼氣系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌群多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷古菌為Methanomicrobiales、Methanosarcinales和Methanobacteriales，分別占序列總數(shù)的41.7%，30%和19%.此外，Methanosarcina sp.穩(wěn)定存在于厭氧發(fā)酵系統(tǒng)，也十分有利于低溫條件下厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行.

由此可見(jiàn)，如何調(diào)控微生物成為降解和產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的群落組成結(jié)構(gòu)及活性較強(qiáng)的產(chǎn)甲烷菌類群，是提高系統(tǒng)運(yùn)行效率的關(guān)鍵.為使厭氧消化系統(tǒng)高效運(yùn)行及調(diào)控，可進(jìn)行生物相的分離，使有機(jī)底物的降解和產(chǎn)酸過(guò)程與產(chǎn)甲烷過(guò)程分離，提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性.此外，通過(guò)調(diào)整運(yùn)行參數(shù)、底物性質(zhì)及投加外源菌群調(diào)控等策略，使產(chǎn)酸系統(tǒng)微生物類群由動(dòng)物消化系統(tǒng)內(nèi)微生物類群主導(dǎo)的組成過(guò)渡為對(duì)纖維類底物降解能力更強(qiáng)的群落組成，提高底物降解及揮發(fā)性有機(jī)酸的轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)適當(dāng)調(diào)整產(chǎn)甲烷相的運(yùn)行參數(shù)，提高產(chǎn)甲烷效率.

4 結(jié) 論

1）本研究利用454焦磷酸高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)北方規(guī)模最大的海林農(nóng)場(chǎng)沼氣池細(xì)菌群落進(jìn)行多樣性與結(jié)構(gòu)解析，得1 297條高質(zhì)量細(xì)菌序列，在屬分類水平上的覆蓋率為66.8%，至少存在581個(gè)細(xì)菌屬.

2）聚類分析結(jié)果表明，沼氣池細(xì)菌包括13個(gè)細(xì)菌門，最優(yōu)勢(shì)類群為Firmicutes，其次為Bacteroidetes和Proteobacteria.在屬分類水平上，Proteiniphilum sp.為最優(yōu)勢(shì)微生物類群，其次分別為Spirochaeta sp.和Wolinella sp..

3）DGGE條帶分析表明，沼氣池產(chǎn)甲烷菌包括Methanocorpusculum sp.、Methanosaeta sp.、Methanobacterium sp.及Methanosarcina sp.，其中Methanosaeta sp.和Methanosarcina sp.是沼氣池內(nèi)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌.

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（編輯 劉 彤）

Analysis of microbial community in a full-scale biogas digester of cold region using high-throughput sequencing technology

ZHAO Guang1，2，MA Fang1，2，SUN Ting3，LI Shuben4，YOU Kong4，ZHAO Zhen1，2
（1.State Key Lab of Urban Water Resource and Environment，Harbin Institute of Technology，150090 Harbin，China；2.School of Municipal and Environmental Engineering，Harbin Institute of Technology，150090 Harbin，China；3.School of Chemical and Environmental Engineering，Liaoning University of Technology，121001 Jinzhou，Liaoning，China；4.Hailin Farm，150000 Mudanjiang，Heilongjiang，China）

To realize the stable and efficient operation of biogas digester in cold region，a combined regulation technique of microbial community should be established.The microbial community in the largest full-scale digester of Hailin Farm was investigated using 454 pyrosequencing technology and PCR-DGGE.The massively parallel sequencing technology was used to measure bacterial diversity of biogas slurry during a stable operation.A total of 1297 sequences were obtained，and the dominant bacteria were Firmicutes，Bacteroidetes and Proteobacteria，which accounted for 46.39%，21.41%and 18.98%，respectively.At genus level（the relative abundances＞5.0%），Proteiniphilum，Spirochaeta and Wolinella were the abundant taxa.The diversitiesofmethanogenwereanalyzedusingPCR-DGGE，andthedetectedarchaeawere Methanocorpusculum sp.，Methanosaeta sp.，Methanobacterium sp.and Methanosarcina sp..Notably，the methane produced by acetoclastic methanogens，and dominant fermentative bacteria during the hydrolysis and acidogenesis were detected form animal digestive system.

biogas；microbial community；Hailin Farm；cow manure；454 pyrosequencing technology

X705

A

0367-6234（2014）04-0036-07

2013-03-20.

國(guó)家科技支撐計(jì)劃專題項(xiàng)目（2012BAD14B06-04）；遼寧工業(yè)大學(xué)教師科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（X201310）.

趙 光（1980—），男，博士研究生；

馬 放（1963—），男，教授，博士生導(dǎo)師.

馬放，mafang＠hit.edu.cn；孫婷，suntinghit＠126.com.