邊立忠，高 松

(1淄博市齊都醫(yī)院，山東淄博255400;2青島市即墨疾病控制中心)

我國(guó)是原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)高發(fā)國(guó)家，全世界50%以上的新發(fā)和死亡 HCC發(fā)生在中國(guó)［1，2］。超過(guò)60%的HCC患者在初次就診時(shí)已經(jīng)進(jìn)入中晚期，其5年總生存率只有7%左右［3］。原癌基因的過(guò)表達(dá)和抑癌基因的表達(dá)下調(diào)或功能缺失都會(huì)導(dǎo)致HCC。DKK1在腫瘤進(jìn)程中的作用已引起廣泛關(guān)注，但在腫瘤中的表達(dá)水平有很大差異，其作用機(jī)制尚未清楚。2011年3月～2013年8月，我們觀察了腺病毒介導(dǎo)的特異性抑制DKK1(shDKK1)基因?qū)CC細(xì)胞增殖的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚胎腎細(xì)胞株HEK293購(gòu)自美國(guó)ATCC公司;人HCC細(xì)胞株SMMC-7721購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù);兔抗DKK1多克隆抗體、鼠抗GAPDH單克隆抗體、β-鏈蛋白(β-catenin)、C-Myc、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔IgGHRP、山羊抗鼠IgG-HRP抗體購(gòu)自Santa Cruz;ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)買(mǎi)自Millipore公司;各種限制性?xún)?nèi)切酶、DL5000 Marker、T4 DNA連接酶、RTPCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司;其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 DKK1基因shRNA載體構(gòu)建 根據(jù) Gene-Bank的DKK1 mRNA序列NM_012242，設(shè)計(jì)合成3對(duì)shRNA及1對(duì)對(duì)照引物。上游引物DKK1-1F:5'-GATCCCGGTTCTCAATTCCAACGCTATCAAGAGTAG CGTTGGAATTGAGAACCGTTTTTTA-3'，下游引物D KK1-1R:5'-AGCTTAAAAAACGGTTCTCAATTCC-AA CGCTACTCTTGATAGCGTTGGAATTGAGAACCGG-3';上游引物DKK1-2F:5'-GATCCCCAGAAGAACCACCTTGTCTTTCAAGAGAAGACAAGGTGGTTCTTTGGT-TTTTTA-3'，下游引物DKK1-2R:5'-AGCTTAAAAAA CCAGAAGAACCACCTTGTCTTCTCTTGAAAGACAAGGTGGTTCTTCTGGG-3';上游引物 DKK1-3F:5'-GATCCGCCAGTAATTCTTCTAGGCTTTCAAGAGAAGCCTAGAAGAATTACTGGCTTTTTTA-3'，下 游 引 物DKK1-3R:5'-AGCTTAAAAAAGCCAGTAATTCTTCTAGGCTTCTC TTGAAAGCCTAGAAGAATTACTGGCG-3';對(duì)照上游引物Control-F:5'-GATCCCAAATACGAGAGGAGTACCCTTCAAGAGAGGGTACTCCTCTCGTATTTGTTTTTTA-3'，對(duì)照下游引物 Control-R:5'-AGCTTAAAAAACAAATACGAGAGGAGTACCCTCTCTTGAAGGGTACTCCTCTCGTATTTGG-3'。合成的單鏈目的基因片段經(jīng)溶解、雙酶切等，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆，并提交至上海生物工程有限公司測(cè)序驗(yàn)證。陽(yáng)性質(zhì)粒分別命名為pGeneSil-DKK1-1、pGeneSil-DKK1-2、pGeneSil-DKK1-3、pGeneSil-CON，完全符合設(shè)計(jì)要求。

1.2.2 細(xì)胞分組及shRNA轉(zhuǎn)染 SMMC-7721細(xì)胞株孵育傳代，轉(zhuǎn)染前1 d接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞密度達(dá)到80% ～90%。將細(xì)胞分為A、B、C、D 組，分別轉(zhuǎn)染 pGeneSil-DKK1-1、pGeneSil-DKK1-2、pGeneSil-DKK1-3、pGeneSil-CON，嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作。于倒置熒光顯微鏡下觀察SMMC-7721細(xì)胞中綠色熒光蛋白報(bào)告基因的表達(dá)，顯示48 h時(shí)均有較強(qiáng)熒光表達(dá)，其轉(zhuǎn)染率約為70%(見(jiàn)插頁(yè)Ⅱ圖4)。

1.2.3 DKK1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。依照TRIzol操作說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。DKK1的引物為DKK1-RT-F:5'-ATAGCACCTTGGATGGGTATTCC-3'，DKK1-RTR:5'-CTGATGACCGGAGACAAACAG-3';內(nèi)參 GAPDH-F:5'-CATGGGTGTGAACCATGAGAA-3'，GAPDH-R:5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.4 DKK1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用 Western blot法。轉(zhuǎn)染后48 h，按照RIPA說(shuō)明書(shū)提取蛋白，按蛋白30 μg/孔上樣。SDS-PAGE垂直電泳，轉(zhuǎn)移至NC膜。5%脫脂奶粉(溶于PBS-T緩沖液)室溫封閉1 h，兔抗DKK1一抗(1∶500)，鼠抗GAPDH一抗(1∶2 000)，4℃孵育過(guò)夜。PBS-T緩沖液振蕩清洗5 min×3。室溫下加入山羊抗兔 IgG抗體(1∶10 000)或山羊抗鼠IgG抗體(1∶8 000)孵育1 h，同前法洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，X光片曝光顯影。

1.2.5 腺病毒載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 將篩選獲得的最佳DKK1 shRNA片段進(jìn)行雙酶切、凝膠回收，通過(guò)T4 DNA連接試劑盒進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，及雙酶切鑒定。采用Ad EasyTMAdenoviral vector system進(jìn)行重組陽(yáng)性克隆的篩選pAd5-shDKK1，磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，通過(guò)包裝、擴(kuò)增和純化，獲得重組腺病毒Ad5.shDKK1，同時(shí)構(gòu)建攜帶對(duì)照shRNA的重組腺病毒Ad5.shCON。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞于96孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染Ad5.shDKK1(轉(zhuǎn)染組)和 Ad5.shCON(空載組);每個(gè)濃度作4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立PBS作為對(duì)照。

1.2.6 細(xì)胞相對(duì)增殖活力、WNT信號(hào)通路檢測(cè) 采用MTT法分別在轉(zhuǎn)染組和空載組轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)增殖活力，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。參照1.2.4，采用 Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染組和空載組轉(zhuǎn)染48 h后Wnt信號(hào)通路中的β-catenin、CMyc、Cyclin D1、PCNA。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最佳干擾片段篩選 與D組比較，A、B、C組DKK1 mRNA和蛋白的表達(dá)均有不同程度的抑制，其中作用最強(qiáng)的是C組，P均＜0.05。見(jiàn)圖1。

圖1DKK1 mRNA和蛋白表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染組和空載組細(xì)胞相對(duì)增殖活力及Wnt信號(hào)通路比較 轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h的細(xì)胞相對(duì)增殖活力分別為133.65%±11.30%、169.41%±4.64%、251.39%±13.86%、336.70%±16.62%，空載組分別為 94.65%±1.77%、98.01%±3.28%、93.80%±2.26%、93.41%±2.22%;兩組同時(shí)間點(diǎn)比較，P 均 ＜0.01。轉(zhuǎn)染組 β-catenin、C-Myc、Cyclin D1、PCNA 分 別 為 568.59%± 25.36%、351.26%±13.43%、295.35%±45.56%、125.35%±23.61%，空載組分別為 102.23%±4.53%、98.65%±7.89%、101.35%±9.23%、97.65%±6.87%，P 均 ＜0.05。

3 討論

HCC惡性程度極高，具有發(fā)展快、病死率高等特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞增殖與凋亡失衡是腫瘤形成和發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制，該過(guò)程涉及多個(gè)基因的改變，并受著復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)［5］。DKK是在進(jìn)化過(guò)程中很保守的基因家族，在脊椎動(dòng)物中包括 DKK1、DKK2、DKK3和 DKK4 4個(gè)成員。DKK家族成員都是分泌型的糖蛋白，除DKK3外均可以參與調(diào)控Wnt信號(hào)通路［4］。在不同的Wnt信號(hào)途徑中，DKK僅僅特異性地影響經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，而對(duì)于Wnt/PCP通路及Wnt/Ca2+通路沒(méi)有明顯的作用［5］。DKK1是一種分泌型糖蛋白，能夠與細(xì)胞膜上的 Wnt受體 LRP5和Kremenl結(jié)合，從而形成內(nèi)吞小體，阻斷 Wnt信號(hào)通路［6，7］。DKK1在胃腸癌、乳腺癌和惡性膠質(zhì)瘤中表達(dá)增加［8，9］，在 HCC、食管癌、黑色素瘤等中表達(dá)明顯升高［10，11］，這種差異性表達(dá)在腫瘤中的作用尚不清楚。

腺病毒載體介導(dǎo)的對(duì)DKK1基因的RNA干擾有很多優(yōu)點(diǎn)［12］，優(yōu)于常規(guī)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法［13］，可獲得更高的、更穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效果。腺病毒載體攜帶的基因效率一般更高，容易制備獲得高滴度病毒，表達(dá)的外源基因更高效;另外，腺病毒轉(zhuǎn)染多種類(lèi)型的人組織細(xì)胞，從而獲得廣譜的轉(zhuǎn)基因作用。腺病毒安全性更高，不會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組。因此，腺病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾對(duì)于研究HCC及其他腫瘤的生物學(xué)功能具有廣泛的應(yīng)用前景和重要的理論和實(shí)踐意義。

Wnt信號(hào)途徑的異常激活可以啟動(dòng)下游多種癌基因的轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致正常細(xì)胞的癌變。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路的激活是HCC發(fā)生的主要分子機(jī)制之一［7，14］。在腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，WNT/β-catenin信號(hào)途徑的異常激活通常能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，因此，鑒定引起WNT/β-catenin信號(hào)途徑異常激活的成因，檢測(cè)核心Wnt信號(hào)通路分子可為腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)測(cè)預(yù)后提供指導(dǎo)［15］。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組 WNT信號(hào)通路中的 β-catenin、C-Myc、Cyclin D1、PCNA 和轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h 的細(xì)胞相對(duì)活力均高于空載組，說(shuō)明在 HCC細(xì)胞系SMMC7721中下調(diào)DKK1基因的表達(dá)會(huì)引起HCC細(xì)胞的增殖，可能與激活 Wnt信號(hào)通路的表達(dá)有關(guān)。

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圖4 SMMC7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA后綠色熒光蛋白表達(dá)情況