徐紅梅，牛澤軍，褚海辰

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266003)

阿片類藥物是緩解中重度疼痛最常用的藥物，慢性疼痛常需要長期應(yīng)用阿片類藥物，但反復(fù)應(yīng)用該類藥物易導(dǎo)致鎮(zhèn)痛耐受［1］，耐受的細(xì)胞和分子生物學(xué)機制目前仍不清楚。近年來研究證實，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞［2～4］、神經(jīng)炎癥［4～6］以及黑皮質(zhì)素受體系統(tǒng)［7～9］在嗎啡耐受形成和調(diào)節(jié)中具有重要作用;黑皮質(zhì)素受體在腦和脊髓分布廣泛，且在脊髓膠質(zhì)細(xì)胞也有表達［10，11］。我們于2009年1月 ～2012年12月進行本研究，探討黑皮質(zhì)素受體拮抗劑(HS014)對嗎啡耐受大鼠脊髓組織OX-42及腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達的影響及意義。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠30只，體質(zhì)量220～250 g，由青島市藥物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理方法 將大鼠隨機分為5組，每組6只。嗎啡耐受組(M組):腹腔注射鹽酸嗎啡注射液，10 mg/(kg·次)、2次/d，注射時間分別為8:00 am和5:00 pm，連續(xù)給藥5 d。生理鹽水組(N組):腹腔注射相同體積的生理鹽水，其余處理及方法均同M組。HS014+嗎啡組(HM組):大鼠每天第2次(5:00 pm)腹腔注射鹽酸嗎啡注射液前 15 min 鞘內(nèi)置管注射(方法見 1.2.2)5 μg HS014，其余處理及方法均同M組。生理鹽水+嗎啡組(NM組):大鼠每天第2次(5:00 pm)腹腔注射鹽酸嗎啡注射液前15 min鞘內(nèi)注射5 μL生理鹽水，其余處理及方法均同M組。HS014+生理鹽水組(HN 組):大鼠腹腔注射生理鹽水，5 μL/次、2次/d，注射時間分別為8:00 am和5:00 pm，每天第2次腹腔注射生理鹽水前15 min鞘內(nèi)注射HS014 5 μg，連續(xù)給藥5 d。大鼠痛閾值與基礎(chǔ)值沒有差異被認(rèn)為嗎啡耐受形成。

1.2.2 鞘內(nèi)置管 根據(jù) Yaksh等［12］方法，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液400 mg/kg;充分麻醉后，于后枕部正中線切開皮膚，鈍性分離頸部肌肉，充分暴露寰枕膜;用22 G注射器針頭輕輕刺破寰枕膜，可見清亮腦脊液流出;由此輕柔置入，術(shù)前充滿無菌水的無菌聚乙烯管(PE-10:OD 0.5 mm，ID 0.25 mm)至大鼠脊髓腰膨大處(深度為7～8cm);導(dǎo)管置入后立即緩慢注射10 μL 0.9%NaCl;封閉導(dǎo)管外口，固定導(dǎo)管;以4-0手術(shù)線分層縫合肌肉與皮膚。術(shù)后出現(xiàn)后肢癱瘓、運動功能障礙的大鼠均剔除實驗。接受置管的大鼠，術(shù)后至少恢復(fù)1周。

1.2.3 脊髓標(biāo)本制作 各組大鼠于第5天實驗結(jié)束后，用10%水合氯醛溶液(400 mg/kg)充分麻醉后迅速打開胸腔，暴露心臟和升主動脈;將針頭從心臟左心室插入直到升主動脈，剪開右心耳，先用生理鹽水快速灌注，待右心耳流出的液體變?yōu)榈t色，繼續(xù)以含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS(pH 7.2)500 mL灌注固定30～60 min。沿坐骨神經(jīng)向上分離至大鼠脊髓處，定位L4～6段脊髓;用骨鉗小心咬開椎板，取出L4～6段脊髓，在4℃、4%多聚甲醛溶液中固定過夜至組織塊沉底;取腰膨大處標(biāo)本，置于10%中性甲醛固定液中固定12 h，然后以0.1 mol/L PBS液洗滌3次(共120 min)。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟浸潤包埋成蠟塊，切片機連續(xù)5 μm橫斷面切片，置于0.01 mol/L PBS內(nèi)備用。

1.2.4 脊髓組織OX-42、TNF-α 檢測 采用免疫組織化學(xué)法，步驟參照試劑盒說明書。每只大鼠取連續(xù)5個脊髓切片，于Olympus數(shù)字顯微鏡系統(tǒng)(×400)下觀察，每張切片隨機選取3個視野進行數(shù)碼拍照，應(yīng)用專業(yè)圖像分析軟件(Image pro-Plus 6.0)對OX-42、TNF-α陽性細(xì)胞進行計數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間、組內(nèi)比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組大鼠脊髓組織OX-42、TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)比較見表1。

表1 各組大鼠脊髓組織OX-42、TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)比較(個，±s)

表1 各組大鼠脊髓組織OX-42、TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)比較(個，±s)

注:與 N組比較，*P ＜0.01;與 M 組比較，△P ＜0.01

組別 n OX-42陽性細(xì)胞 TNF-α陽性細(xì)胞N組6 12.20±1.99 28.40±1.14 M 組 6 31.90±3.03* 99.30±2.12*HM 組 6 23.10±2.33＊△ 61.00±1.28＊△NM 組 6 32.00±1.89* 92.60±1.43*HN組6 12.50±1.58 26.10±0.85

3 討論

慢性應(yīng)用嗎啡能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞激活［2～4，13］，并能夠增加促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達［5，6］，即促炎細(xì)胞因子的釋放正是膠質(zhì)細(xì)胞激活的結(jié)果［4，14］。激活的膠質(zhì)細(xì)胞能夠釋放促炎細(xì)胞因子和其他神經(jīng)興奮性物質(zhì)，拮抗嗎啡的鎮(zhèn)痛作用，易化疼痛，引起嗎啡耐受［2，4，6，14］。釋放的促炎細(xì)胞因子也可通過旁分泌的形式作用于遠程細(xì)胞，使疼痛相關(guān)的遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)如興奮性氨基酸(EAA)、NO、前列腺素(PGs)等從初級傳入末端釋放［15］，或直接作用于神經(jīng)元和其他受體系統(tǒng)，促進嗎啡耐受形成。而聯(lián)合給予膠質(zhì)細(xì)胞代謝抑制劑、細(xì)胞因子拮抗劑、IL-10或IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)，能夠維持嗎啡的鎮(zhèn)痛作用，抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而抑制嗎啡耐受、痛覺過敏和異常性疼痛的形成［4，6，13，16］。應(yīng)用其他膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑也得到相同結(jié)果。米諾環(huán)素和己酮可可堿通過降低小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CD11b/c蛋白水平，抑制嗎啡耐受的發(fā)生;此外，兩種藥物抑制嗎啡耐受的作用也與減少 IL-6、TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生和興奮 IL-10 相關(guān)。Tai等和 Mika等研究［5，17］也證實，慢性嗎啡耐受能誘導(dǎo)興奮性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)水平顯著增加，IL-6、TNF-α、IL-1β 表達增加，谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLAST、GLT-1和EAAC1表達下調(diào)，而聯(lián)合給予阿米替林能防止和減弱嗎啡的耐受作用;其作用機制可能是抑制促炎因子的表達，阻斷谷氨酸轉(zhuǎn)運體下調(diào)，甚至上調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體(GLAST和GLT-1)的表達，減弱嗎啡誘導(dǎo)的EAA釋放。Johnston等［18］也證實，嗎啡耐受能夠增加促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，并且IL-1β能抑制嗎啡的鎮(zhèn)痛作用，從而促進嗎啡耐受的形成，而抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生能夠恢復(fù)阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用［19］。

本研究結(jié)果表明，腹腔內(nèi)給予嗎啡可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生嗎啡耐受，在此過程中，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，表現(xiàn)為OX-42表達顯著增加，并釋放大量TNF-α;黑皮質(zhì)素受體拮抗劑HS014能夠減輕嗎啡耐受，機制可能與其抑制嗎啡引起的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及TNF-α釋放有關(guān)，但其調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的確切機制仍有待進一步研究。

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