艾春雨，江曉菁，馬 虹，王俊科

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽(yáng)110001)

脊髓缺血再灌注損傷是脊柱手術(shù)、動(dòng)脈瘤手術(shù)中常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。截癱是脊髓缺血再灌注損傷后難以預(yù)測(cè)和最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一［1］。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)正在發(fā)生心肌梗死的患者行冠狀血管成形、支架植入后血管再通即刻行3個(gè)循環(huán)的氣囊放氣充氣處理，可使心肌梗死范圍縮小、反映心肌再灌注的指標(biāo)分級(jí)增加，且無不良反應(yīng)，提示該球囊式缺血后處理具有心肌保護(hù)作用［2，3］。將再灌注早期灌注壓控制在較低水平(45～55 mmHg)，即控制性低壓后處理，沒有附加缺血，操作簡(jiǎn)便，更易于臨床應(yīng)用。我們于2012年1～12月進(jìn)行本研究，探討控制性低壓后處理對(duì)兔脊髓缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 日本大耳白兔32只，雄性，體質(zhì)量2～2.5 kg，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為4組，每組8只，即假手術(shù)對(duì)照組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)、控制性低壓后處理組(P組)、控制性低壓后處理+ERK1/2抑制劑PD98059組(PD組)。

1.2 方法

1.2.1 缺血再灌注模型的制備 方法參照文獻(xiàn)［3］。模型制備前12 h禁食，自由飲水。耳緣靜脈注射20%烏拉坦1 mg/kg麻醉;常規(guī)監(jiān)測(cè)心率和血壓;耳緣中動(dòng)脈穿刺置管，監(jiān)測(cè)近端動(dòng)脈血壓;股動(dòng)脈穿刺置管監(jiān)測(cè)遠(yuǎn)端動(dòng)脈血壓;應(yīng)用電熱毯保溫，維持直腸溫度(38.5±0.5)℃;耳緣靜脈穿刺置管，靜脈輸注復(fù)方乳酸鈉林格氏液4 mL/(kg·h);將4 F球囊充氣導(dǎo)管置于左腎動(dòng)脈下1cm水平，靜注肝素150 U/kg后5 min，阻斷腹主動(dòng)脈進(jìn)行缺血，遠(yuǎn)端動(dòng)脈壓＜20 mmHg為缺血成功的標(biāo)準(zhǔn)，缺血25 min時(shí)進(jìn)行再灌注，動(dòng)脈搏動(dòng)恢復(fù)為再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn)。缺血后處理方法參照前期研究［4］。

1.2.2 鞘內(nèi)注射方法 于L5～6間隙行蛛網(wǎng)膜下腔穿刺，將已消毒的 PE-10導(dǎo)管從 L5～6插入7.0～8.0cm，至脊髓胸段以回抽到腦脊液作為穿刺成功的標(biāo)志。緩慢抽出等量腦脊液后注入實(shí)驗(yàn)藥物，注射后保持頭高腳低體位1 h。

1.2.3 各組處理方法 ① S組:將4 F球囊充氣導(dǎo)管置于左腎動(dòng)脈下1cm水平，不行阻斷。② I/R組:再灌注時(shí)排空球囊，其余方法同1.2.1。③ P組:再灌注開始10 min后，將球囊部分排空，使腹主動(dòng)脈遠(yuǎn)端血壓控制在45～55 mmHg，10 min后球囊完全開放，其余方法同1.2.1。④ PD組:于腹主動(dòng)脈開放前1 min鞘內(nèi)注射 PD98059(3 μg/20 μL)，其余方法同P組。于再灌注24 h時(shí)，腹腔注射20%烏拉坦1 mg/kg，處死動(dòng)物。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.4.1 細(xì)胞凋亡 采用TUNEL法。取L3～4節(jié)段脊髓組織，10%甲醛溶液中固定，脫水、切片后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明書進(jìn)行操作。在高倍鏡下(×400)隨機(jī)選擇6個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，取平均值，計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。細(xì)胞核呈棕黃色為凋亡細(xì)胞。

1.2.4.2 脊髓組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量測(cè)定 羥胺法測(cè)定脊髓組織SOD含量，硫代巴比妥酸法測(cè)定脊髓組織MDA含量。

1.2.4.3 脊髓組織 p-ERK1/2、Caspase-3檢測(cè) 采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法。取L4～5節(jié)段脊髓組織，10%甲醛固定，脫水，石蠟切片(5 μm)。免疫組化步驟參照HistostainTMPlus Kits S-P 9000免疫組化染色試劑盒說明書(武漢博士德生物工程有限公司)。p-ERK1/2多克隆抗體稀釋度為1∶500、Caspase-3抗體稀釋度為1∶100。細(xì)胞核及胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。光鏡下(×400)隨機(jī)選擇6個(gè)視野，采用AX70顯微圖像分析系統(tǒng)(Olympus公司，日本)進(jìn)行分析，以平均光密度值反映p-ERK1/2及Caspase-3的表達(dá)水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組脊髓組織神經(jīng)元凋亡指數(shù)，SOD、MDA含量，Caspase-3、p-ERK1/2表達(dá)結(jié)果見表1。

表1 各組脊髓組織神經(jīng)元凋亡指數(shù)、SOD、MDA、Caspase-3、p-ERK1/2比較 (±s)

表1 各組脊髓組織神經(jīng)元凋亡指數(shù)、SOD、MDA、Caspase-3、p-ERK1/2比較 (±s)

注:與 S組比較，*P ＜0.05;與 I/R 組比較，△P ＜0.05;與 P組比較，#P ＜0.05

組別 n 凋亡指數(shù)(%) SOD［U/(g·prot)］ MDA［U/(g·prot)］Caspase-3 p-ERK1/2 S 組 8 2.76±0.25 312.25±19.56 1.02±0.21 39.22±15.30 29.32±11.53 I/R 組 8 45.43±5.15* 73.42±15.36* 7.62±0.33* 152.01±20.21* 82.01±21.32*P 組 8 17.24±3.63＊△ 179.76±16.33＊△ 3.66±0.58＊△ 107.45±19.16＊△ 192.82±29.71＊△PD 組 8 65.43±3.39*# 85.73±20.13*# 5.32±0.67*# 202.31±22.35*# 90.01±20.65*#

3 討論

研究證實(shí)，自由基損傷及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注損傷的重要機(jī)制［4］。而脊髓組織膜結(jié)構(gòu)含有豐富的脂質(zhì)，易導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元的繼發(fā)性損害。SOD活性可反映氧自由基清除能力的高低，而MDA是目前公認(rèn)的能較好反映機(jī)體內(nèi)氧自由基水平及脂質(zhì)過氧化損傷程度的間接指標(biāo)。研究顯示，SOD、MDA測(cè)定可以反映缺血再灌損傷的嚴(yán)重程度［5］，缺血后控制性低壓處理也可以影響活性氧自由基的生成［6，7］。本研究中缺血再灌注組MDA含量明顯增多，SOD含量明顯減少，提示脊髓組織損傷較重;控制性低壓后處理組MDA含量下降、SOD含量上調(diào)，提示組織抗氧化能力增強(qiáng)，脊髓組織損傷減輕;而PD98059可以抑制控制性低壓后處理引起的抗組織氧化能力的增強(qiáng)。

ERK1/2是絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一員，在將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如凋亡)的過程中具有至關(guān)重要的作用，是信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)的傳遞者。ERK1/2活化引起細(xì)胞的增殖與分化［8］?；罨腅RK1/2(p-ERK1/2)從胞質(zhì)進(jìn)入胞核，影響細(xì)胞功能狀態(tài)。一些學(xué)者認(rèn)為，ERK1/2通路激活作用與適應(yīng)、上調(diào)抗氧化因子轉(zhuǎn)錄等保護(hù)作用有關(guān)［9，10］。ERK1/2信號(hào)途徑與腦缺血后神經(jīng)元存活有關(guān)［11］，其是否參與脊髓缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用尚待進(jìn)一步研究。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)［3］，控制性低壓后處理促進(jìn)ERK1/2蛋白的磷酸化，減少細(xì)胞凋亡。本研究中，缺血再灌注時(shí)脊髓組織p-ERK1/2表達(dá)上調(diào)，其原因可能與脊髓缺血再灌注期間微循環(huán)障礙，導(dǎo)致缺氧啟動(dòng)修復(fù)有關(guān);而缺血后控制性低壓處理使p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，從而減輕脊髓缺血再灌注損傷。

Caspase家族是哺乳動(dòng)物凋亡機(jī)制中的關(guān)鍵因素，其中Caspase-3被認(rèn)為是此級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最具關(guān)鍵效應(yīng)的凋亡蛋白酶，是缺血再灌注損傷的重要事件。正常情況下，胞質(zhì)中Caspase-3以無活性酶形式存在，被凋亡信號(hào)激活后成為活性酶，活性的Caspase-3進(jìn)一步切割不同底物，導(dǎo)致DNA裂解，最終使細(xì)胞走向死亡［12～16］。本研究發(fā)現(xiàn)，與缺血再灌注損傷組比較，控制性低壓后處理組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，而ERK1/2抑制劑PD98059阻斷了這種作用，提示缺血后控制性低壓后處理可通過ERK1/2途徑調(diào)控Caspase-3凋亡基因的表達(dá)。

綜上所述，控制性低壓后處理對(duì)脊髓缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與活化ERK1/2、抑制Caspase-3有關(guān)。

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