曹 建， 孫學輝， 路鐵剛

中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京100081

水稻矮桿基因在研究水稻株型發(fā)育機理，詮釋植物生長發(fā)育機制中扮演著重要的角色。水稻的株高變矮是由矮桿主效基因控制，同時也受到修飾基因、調(diào)節(jié)基因以及抑制基因的共同影響。矮桿基因的作用可以導致水稻植株水平或者細胞水平的變化，如節(jié)間變短，細胞個數(shù)下降，進而植株變矮。水稻的株高發(fā)育還與植物激素有關。在已克隆的與水稻株高發(fā)育有關的基因中，與赤霉素有關的有 SD1［1］、SLR1［2］和 EUI1［3］等，與油菜素內(nèi)酯(BR)有關的有 D11［4］、BRD1［5］和 D2［6］等。其中SLR1和EUI1為高桿基因，SD1為半矮稈基因，其余為矮桿基因。這些基因在赤霉素或油菜素內(nèi)酯的合成或信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮著重要作用。

水稻的籽粒大小是水稻產(chǎn)量的主要影響因素之一，并直接影響稻米的外觀和品質(zhì)。研究水稻控制水稻籽粒發(fā)育相關的基因，明確水稻籽粒生長發(fā)育的機理，對于解釋水稻生殖生長的模式以及培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻品種有著重要作用。目前，水稻分子生物學家已經(jīng)利用突變體對小粒基因做過了大量研究，如H346/L32以及Kitaake中的小粒基因 MI1和 MI2［7～14］;來源于斯里蘭卡的突變體club mutant的圓短?；騅R1［15］等。其余的小粒性狀基因還控制著稻谷芒、籽粒紋理、圓籽粒以及株高等性狀。伴隨籽粒紋理性狀出現(xiàn)小粒性狀的基因有LGT［16］，伴隨圓籽粒性狀出現(xiàn)小粒性狀的基因有 RK1、RK2［17，18］，伴隨芒性狀出現(xiàn)小粒性狀的基因有 AN6、AN7［15］，伴隨矮桿性狀出現(xiàn)小粒性狀的基因有 D56、D2、D54、DK6、DWF33、DWF1 和 D38 等［6，14，19～21］。

本文以1份水稻矮桿小粒材料t129為基礎，通過與水稻秈稻亞種Dualr雜交得到F1代和F2代群體，對該突變體的矮桿小粒性狀進行遺傳分析，以確定該突變體的遺傳規(guī)律，同時利用Dular/t129雜交F2代群體定位了一個隱性矮桿小?；颉?/p>

1 材料與方法

1.1 水稻材料

水稻矮桿小粒突變體來源于本實驗室構建的T-DNA插入突變體庫［22］，遺傳背景為粳稻品種日本晴。經(jīng)過河北和海南多代自交和選擇，突變體表型穩(wěn)定，受種植環(huán)境影響極小，是遺傳穩(wěn)定的品系。本實驗中，水稻野生型材料為粳稻品種日本晴(Oryza Sativa L.spp.Japonica cv.Nipponbare)和秈稻品種Dular。

1.2 表型觀察

將日本晴與純合突變體t129種植于田間，種植10行，每行10株。成熟后分別在中間兩行選擇20株，調(diào)查株高、千粒重、結實率。

1.3 遺傳分析及基因定位的群體構建

以矮桿小粒突變體t129為母本(P1)與野生型粳稻品種日本晴(P2)進行正反交，收取F1代種子，種植后進行自交得到F2代種子。將F2代種子種植。觀察雜交組合F1、F2群體中出現(xiàn)野生型表型和矮稈小粒表型植株的數(shù)量，對矮桿小粒突變體進行遺傳分析。

利用矮桿小粒突變體t129/秈稻品種Dular(P3)的F2(P1/P3)群體作為基因定位群體。

1.4 基因組DNA提取

根據(jù)突變體t129與Dular雜交組合F2代植株表型，選取隱性表型單株10株，分成兩組各5株，每組剪取等量葉片混合，構建隱性表型基因池。采用改進的CTAB法［23］提取隱性表型基因池。精細定位時用同樣方法提取用于連鎖分析的F2代單株DNA。

1.5 InDel分子標記分析

本實驗所用InDel引物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。利用網(wǎng)上所公布的粳稻亞種日本晴和秈稻亞種9311的全基因組序列進行比對，利用在秈稻粳稻之間片段大小差異設計引物，引物設計軟件為DNAMAN，引物設計完成后，在日本晴和Dular兩個雜交親本之間檢測多態(tài)性。然后利用多態(tài)性引物對前述Dualr/t129 F2隱性表型混池進行初定位，再用與該混池連鎖的初定位標記對隱性F2代全部單株進行連鎖分析，確定引物與F2代隱性表型群體的連鎖關系。本研究開發(fā)的部分InDel標記見表1。

PCR 擴增體系(10 μL)為:ddH2O 6.1 μL，10× PCR Buffer 1 μL，MgCl2(25mmol/L)0.6 μL，dNTP Mix(1mmol/L)0.2 μL，引物(2 pmol，正向+反向)1 μL ，Takarar Taq(5 U/μL)0.1 μL，DNA模板(20 ng/μL)1 μL。PCR 擴增程序為:94℃預變性 5min;94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸30 s，擴增 5個循環(huán);第二步，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸 30 s，擴增33 個循環(huán);最后72℃下延伸7min。反應產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電壓200 V，時間2 h 10min。電泳完成后用銀染顯色，在膠片觀察燈下觀察結果并照相。將電泳圖譜進行數(shù)值轉(zhuǎn)換:與隱性親本帶型一致的記為1型帶，與顯性親本帶型一致的記為2型帶，同時具有雙親本帶型的的記為3型帶。

表1 本研究開發(fā)的多態(tài)性InDel標記Table 1 Polymorphic InDel markers used in this study.

1.6 遺傳作圖與基因定位分析

利用Mapmaker軟件對轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)進行分析，并進行遺傳作圖［24］，對矮桿小?；蜻M行定位分析。

2 結果與分析

2.1 t129小粒突變體的表觀性狀的遺傳分析

2.1.1 t129突變體與野生型親本的性狀差異通過田間測定，原始親本日本晴植株平均高度為91cm，而 t129突變表型植株平均高度為51cm，突變植株高度明顯下降矮化(見圖1A，彩圖見227頁圖版)。同時突變植株與原始親本植株日本晴的粒長相比也明顯縮短(見圖1B)，平均長度由野生表型的0.768cm縮短為0.562cm，千粒重也明顯下降(見表2)。

圖1 成熟期野生型t129的植株形態(tài)與籽粒粒型Fig.1 Phenotype of the wild type and t129 mutant at mature stage.

2.1.2 突變體t129的遺傳分析 將純合t129突變體與日本晴進行雜交，獲得F1代雜交種子。種植F1代植株，對其植株高度和籽粒形態(tài)進行觀察。如表3所示，F(xiàn)1代粒長均偏向于野生型親本。如日本晴/t129的F1代粒長平均值為0.742cm，明顯偏向于野生型親本日本晴(平均粒長為0.768cm)。在日本晴/t129雜交F1代中株高性狀也同樣偏向于日本晴。由此可見，t129突變體矮桿小粒的性狀受隱性基因控制。

表2 突變體t129日本晴的農(nóng)藝性狀分析Table 2 Agronomic traits of the wild type and the t129 mutant.

表3 突變體t129與日本晴及其雜種F1代株高和粒長性狀統(tǒng)計Table 3 Statistics on plant height and grain length among parents and F1.

為了進一步明確矮稈、小粒突變表型是否由單基因控制，將F1代植株進行自交獲得F2代植株群體，并對其進行遺傳分析統(tǒng)計。如表4所示，t129突變體與日本晴的組合F2代分離群體中，野生型表型246株，突變型植株數(shù)85株，卡方值，無顯著性差異，符合3∶1的孟德爾遺傳理論分離比例。日本晴與t129突變體雜交組合F2代分離群體中，野生型表型植株309株，突變體表型植株107株。卡方值=3.84，同樣無顯著性差異，符合3∶1的孟德爾遺傳理論分離比例。以上研究結果表明，矮桿小粒突變體受一對隱形單基因控制。

表4 F2代分離群體的統(tǒng)計分析Table 4 Statistical analysis of the phenotype of F2segregating population.

2.2 t129基因的初步定位

為了進一步克隆突變基因，將日本晴背景的純合t129突變體與Dular雜交獲得F1代，而后F1代自交獲得F2代分離群體，對其突變位點進行精細定位。

用600對InDel引物對親本Dular和日本晴進行多態(tài)性分析，有151對引物在Dular和日本晴之間有多態(tài)性。這151對引物均勻分布在水稻的12條染色體上。用此151對引物對Dular/t129 F2代群體隱性表型植株混池(5株/混池)進行初步染色體定位，發(fā)現(xiàn)兩個DNA混池與5號染色體長臂上rm5-6標記完全連鎖。進而取20株突變體表型單株和10株野生型表型單株對該標記進行驗證，證明 rm5-6與 t129突變位點連鎖，在rm5-6標記上下游合成InDel引物，其中有20對在親本間具有多態(tài)性，其中多態(tài)性較好的標記是InDel3、InDel6、InDel8、InDel31、InDel43、InDel51、InDel57和InDel65，利用88個突變體表型單株將t129定位在rm5-6與InDel65之間，進一步利用426株突變表型(隱性單株)群體和新開發(fā)的分子標記最終把t129基因定位在5號染色體InDel43與InDel57之間，物理距離約430 kb(見圖2)，其中與InDel51共分離(見圖3)。

圖2 t129基因在第5號染色體上的分子定位Fig.2 Molecular mapping of T129 on the chromosome 5.

3 討論

圖3 t129突變位點與InDel51標記連鎖分析Fig.3 Linkage analysis of the mutant locus of t129 with Indel51 marker.

水稻是研究單子葉植物的模式植物之一。水稻矮桿、半矮稈突變體在研究單子葉植物生長發(fā)育調(diào)控模式中也扮演著不可或缺的作用［25，26］。水稻矮桿、半矮稈基因在水稻植株中不僅決定了植株高矮，還在分蘗、莖稈、育性等性狀中發(fā)揮作用，參與水稻植株形態(tài)建成的各種生理生化過程。目前，發(fā)現(xiàn)和報道的水稻矮桿、半矮稈突變體已超過了80個。研究表明大部分分離克隆的矮桿和半矮稈基因與植物的赤霉素、油菜素內(nèi)酯(BR)和獨腳金素內(nèi)酯這三種激素的合成代謝、信號轉(zhuǎn)導有關系。如前述的SD1基因編碼GA20氧化酶，是赤霉素合成途徑中的關鍵酶［27］;水稻GID1基因是從一個極矮、GA不敏感突變體gid1中克隆出來的，它編碼一個類似于激素敏感脂肪酶蛋白，作用于植物特有的GRAS轉(zhuǎn)錄因子N端的DELLA結構域，參與赤霉素信號轉(zhuǎn)導［28］;水稻GID2基因突變也表現(xiàn)出極端矮化的表型，其通過參與泛素介導的蛋白質(zhì)降解負調(diào)控GA信號轉(zhuǎn)導;從水稻矮桿突變體d11中克隆的CYP724B1基因在BR合成中起著關鍵作用［29］;水稻BRD1基因發(fā)生突變可以表現(xiàn)出植株極端矮化，所有節(jié)間均不伸長等表型，該基因編碼一個在BR合成中重要的限速酶［30］;此外，調(diào)控水稻BR信號轉(zhuǎn)導的主要基因如 DLT、IBH1等發(fā)生突變也會導致植株矮化［31，32］。因此，對于水稻矮桿突變體進行研究，能夠進一步揭示水稻株型發(fā)育的分子機制與遺傳機制。目前，在水稻理想株型育種實踐中，矮桿、半矮稈突變體發(fā)揮著重要作用，對矮桿、半矮稈基因的克隆，對其參與的生物學途徑的研究，能夠為我們選育優(yōu)良水稻品種、研究水稻生長發(fā)育的分子機理提供很大幫助。

此外，籽粒大小也是影響水稻產(chǎn)量的重要因素。粒長基因在遺傳基礎上決定著籽粒大小。從以往的報道中我們可以看出，粒長主要為數(shù)量性狀［32～37］。但也有研究表明粒長受單基因控制［38］。在已克隆的與水稻粒長粒型有關的基因中，GW5和GW2與泛素介導的蛋白質(zhì)降解過程有關［39，40］，而 GS3 與細胞信號轉(zhuǎn)導的負調(diào)控有關［41］。此外，根據(jù)前人報道，水稻籽粒的發(fā)育還受植物激素調(diào)節(jié)，如前述的在BR合成中起關鍵作用的 D11基因，其突變體也表現(xiàn)為小粒表型［4］，此外，具有小粒表型的 d2、brd1突變體同樣存在 BR 合成障礙［6，30］。因此，研究控制水稻籽粒發(fā)育的基因，對增進植物發(fā)育的分子機理以及細胞信號轉(zhuǎn)導過程的認識大有裨益。

本研究對一矮桿小粒突變體t129進行了表型分析和初步定位。其株高約為野生型一半，籽粒粒長較野生型明顯減少，是研究水稻株型發(fā)育與籽粒發(fā)育分子機理的良好材料。在分析突變體與野生型配置的正反交雜交組合后，F(xiàn)2群體中野生型表型與突變體表型分離比例符合3:1的遺傳分離比例，由此表明t129突變體由常染色體隱性單基因控制。經(jīng)過精細定位將t129定位到5號染色體長臂上，引物InDel43和InDel57之間，物理距離為430 kb，并與標記InDel51共分離。該結果為進一步研究水稻株高粒型調(diào)控基因、深入研究基因功能奠定基礎。

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