楊瑞紅
新疆教育學(xué)院,烏魯木齊830043
硝基芳香族化合物(nitro-aromatic compounds,NAC)是一種重要的有機(jī)化工原料,主要應(yīng)用于農(nóng)藥、醫(yī)藥和染料等領(lǐng)域,使用量巨大,是土壤、河流和大氣中的主要污染物之一[1]。這類(lèi)化合物中,有些在動(dòng)物皮下、腹腔和肌肉中積累可誘發(fā)癌變等;有些可分解產(chǎn)生NOx類(lèi)的有毒煙霧;有些是氧化和光合磷酸化的強(qiáng)效解偶聯(lián)劑[2]。據(jù)報(bào)道,腸道菌群和哺乳動(dòng)物的器官中包含有非特異性的硝基還原酶,它能夠催化NAC的硝基轉(zhuǎn)化為更有害的亞硝基和羥氨基,對(duì)哺乳動(dòng)物來(lái)講屬于強(qiáng)致癌物[2]。因此這類(lèi)物質(zhì)對(duì)健康和環(huán)境都帶來(lái)潛在的危害。硝基芳香族化合物性質(zhì)穩(wěn)定,具有持續(xù)和多樣的化學(xué)特性,不易降解,且可通過(guò)食物鏈富集放大來(lái)破壞生態(tài)系統(tǒng)。傳統(tǒng)物理清除法不僅成本高而且有二次污染[3]。在自然界,這種外源物所致的生態(tài)壓力大部分通過(guò)生物降解來(lái)解決,微生物代謝可使NAC進(jìn)入生物地化循環(huán),因此利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建質(zhì)粒來(lái)改造微生物可大大促進(jìn)NAC的微生物降解。
硝基芳香族化合物主要來(lái)源于化學(xué)工業(yè),不是天然的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,屬于難于利用的、有害的環(huán)境底物。但微生物具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性,能夠在短期內(nèi)進(jìn)化出新的代謝途徑或者改變已有的代謝途徑來(lái)代謝這些與天然底物結(jié)構(gòu)類(lèi)似的人工合成底物。大多數(shù)生物自身都有硝基還原酶,能夠?qū)AC轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的胺類(lèi),但是在自然條件下,完全分解硝基芳香烴類(lèi)的酶是非常少的,轉(zhuǎn)化過(guò)程經(jīng)過(guò)很多中間產(chǎn)物導(dǎo)致轉(zhuǎn)化速度比較慢。但是只要生物異源物質(zhì)在環(huán)境中持續(xù)存在,微生物群落在其中生存,就能夠在短時(shí)間內(nèi)馴化出可降解硝基芳香烴的不同途徑。
當(dāng)微生物暴露在NAC中時(shí),它有可能經(jīng)歷不同的代謝過(guò)程,如:分解代謝,利用NAC作為唯一的碳/氮源和能量供應(yīng)源,最后形成無(wú)機(jī)終產(chǎn)物如CO2和水;或者共同代謝,這是一種特異地作用于其他底物的酶的非特異性轉(zhuǎn)化NAC的途徑,只有在其他底物存在時(shí)NAC才可以被轉(zhuǎn)化。共同代謝反應(yīng)在無(wú)氧和有氧條件下均可發(fā)生,可以在外加碳源時(shí)氧化或者還原形成最終的低毒或無(wú)毒物質(zhì)。
NAC在生物系統(tǒng)中可被還原產(chǎn)生二級(jí)的非生物偶聯(lián)反應(yīng),形成惰性的偶氮-、氧化偶氮和聚合物。該反應(yīng)由兩類(lèi)反應(yīng)酶催化,ⅠⅡ型酶為氧氣不敏感型,Ⅱ型酶為氧氣敏感型[4]。反應(yīng)酶可將一個(gè)或兩個(gè)電子轉(zhuǎn)移到硝基或亞硝基上,Ⅰ型硝酸還原酶在電子對(duì)供體和無(wú)氧下,最終產(chǎn)生芳香胺;Ⅱ型酶在梭菌屬、大腸桿菌、植物和動(dòng)物中廣泛存在,可還原硝基為亞硝基[5]。生物介導(dǎo)的還原反應(yīng)主要發(fā)生在鄰位,而非對(duì)位。
在無(wú)氧條件下,微生物通過(guò)硝基還原酶催化NAC上的硝基接受共底物連續(xù)供給的電子對(duì)還原成亞硝基衍生物、羥胺或胺。
研究發(fā)現(xiàn),在厭氧條件下,大多數(shù)聚硝基芳香烴易被降解,但只有極少數(shù)厭氧微生物能將NAC底物完全轉(zhuǎn)化成CO2或甲烷,如:洛氏芽胞鹽桿菌(Haloanaerobicum praevalens)可降解硝基苯為芳香胺類(lèi)化合物[6];甲酸甲烷桿菌可完全轉(zhuǎn)化3,4-硝基酚[7];雙酶梭菌(Clostridium bifermentans)可將 2,4,6-三硝基甲苯(TNT)轉(zhuǎn)化為 2,4,6-三氨基甲苯(TAT),再轉(zhuǎn)化為 2,4,6-三苯甲醇[8];真氧產(chǎn)堿桿菌(Ralstonia eutropha)可將3-硝基酚降解為氨基酚[9];羅爾斯通菌可將4-硝基苯甲酸鹽降解成3-羥基-4-對(duì)氨基苯甲酸甲酯[10];耐熱醋酸棱狀芽胞桿菌、Methylobacterium sp.BJ001、克雷白氏桿菌屬C1、瘤胃微生物可將TNT分別還原成三甲苯醇、氨基二硝基甲苯、亞硝酸、2-羥基l-氨基-4,6-二硝基甲苯[11~14]。TNT、二硝基甲苯、3,5-二硝基苯甲酸、2,3,4-硝基酚等化合物的部分或者完全降解需要多個(gè)細(xì)菌菌團(tuán)的協(xié)同參與,如:脫磷弧菌和梭菌屬的純培養(yǎng)可通過(guò)形成三氨基甲苯中間體而快速降解 TNT[5]。
厭氧環(huán)境下的還原率由整個(gè)分子的化學(xué)性質(zhì)(環(huán)和取代基的個(gè)數(shù)和類(lèi)型)來(lái)決定。隨著硝基對(duì)位功能基團(tuán)吸電子能力的增加,硝基還原率會(huì)相應(yīng)增加。研究發(fā)現(xiàn),一種顆粒厭氧污泥可以將硝基酚礦化為甲烷[15],而在氫和其他原電子供體(乙醇等)存在時(shí),產(chǎn)甲烷顆粒淤泥的還原速率會(huì)上升[16]。
好氧微生物對(duì)NAC的降解主要是以單-、雙-硝基芳烴作為完全礦化時(shí)的碳/氮源和能量來(lái)源。如,放射菌類(lèi)可將單硝基酚羥基化,形成亞硝酸和鄰-或?qū)Γu基苯[17]。惡臭假單胞菌2NP8菌株降解殺蟲(chóng)劑(對(duì)硫磷和甲基對(duì)硫磷)時(shí),首先將其水解為4-對(duì)硝基苯酚,隨后在硝基上發(fā)生羥化,此菌株還能夠完全轉(zhuǎn)化30個(gè)單-、雙-硝基芳香烴底物[18]。目前,已分離得到多種降解NAC的好氧微生物,見(jiàn)表1。
表1 好氧微生物對(duì)硝基芳烴化合物的降解Table 1 Degradation of nitro-aromatics by aerobic microorganisms.
目前NAC的生物修復(fù)主要有原位和非原位兩種。
原位生物修復(fù)是在污染的原地進(jìn)行,主要處于實(shí)驗(yàn)研究階段,僅有少數(shù)能在實(shí)際中應(yīng)用。也有研究利用植物與微生物共同在原位作用,如利用柳枝稷、矮菜豆與滅菌的根培養(yǎng)物或它們的混合物轉(zhuǎn)化TNT[26];利用植物根際的假單胞菌進(jìn)行TNT 的根際修復(fù)[20]等。
非原位生物修復(fù)是將污染物從產(chǎn)生地移出后進(jìn)行修復(fù)。由于易操作和可控性,此類(lèi)研究較多。非原位生物修復(fù)常用反應(yīng)器進(jìn)行處理,但成本相對(duì)高。Ziganshin等[27]將 TNT重污染的土壤與水、解脂假絲酵母AN-L15菌株和淀粉等基質(zhì)混合在反應(yīng)器中,最終將TNT降解,該反應(yīng)中有有機(jī)酸中間產(chǎn)物的產(chǎn)生,因此必須調(diào)節(jié)pH以保證其降解率。由于反應(yīng)器中承載的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限,微生物細(xì)胞存活不易,并存在重金屬的抑制和細(xì)胞易洗掉等缺陷,現(xiàn)在又發(fā)展出固定細(xì)菌細(xì)胞技術(shù)(immobilized bacteria technology,IBT)[28],該技術(shù)用粘附/交聯(lián)/截留的方法將細(xì)胞固定在不同基質(zhì)上,如泥炭、瓊脂糖、粘土、藻酸鹽、硅藻土和k-角叉萊膠等,或自行固定在顆粒泥漿上,生物修復(fù)的加載率和修復(fù)率都較反應(yīng)器法有所提高。Sreenivasulu等[29]用3%海藻膠固定芽胞桿菌成功降解了硝基酚;Peres等[30]用硅藻土固定洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)PB4對(duì)4-硝基苯甲酸鹽和4-苯佐卡因混合物進(jìn)行了高效降解;Mulla等[31]實(shí)現(xiàn)了聚氨酯包裹微球菌SMN-1對(duì)土壤中二硝基甲苯的生物修復(fù);相對(duì)于反應(yīng)器中的游離細(xì)胞,固定化細(xì)胞對(duì)pH條件和pH變化更有耐受性。而且兩個(gè)菌株共同固定比單獨(dú)固定一類(lèi)細(xì)胞效果更好,Arora等[32]在藻酸鈣上共同固定硝基還原的厭氧腸道菌(Enterobacter)和礦化4-氯-2-硝基酚的好氧產(chǎn)堿桿菌屬(Alkaligenes),最終將4-氯-2-硝基酚完全降解;在藻酸鹽微珠上共同固定叢毛單胞菌屬(Comamonas)JS46和JS47也成功清除了重工業(yè)廢水中的對(duì)硝基苯甲酸[33]。
利用分子生物學(xué)技術(shù)改造基因來(lái)提高微生物系統(tǒng)的修復(fù)性能是目前的研究熱點(diǎn)之一。
NAC類(lèi)化合物的降解過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的酶反應(yīng)過(guò)程,提升降解速率可通過(guò)錨定限速步驟來(lái)改進(jìn),如提高限速酶的表達(dá)量或者穩(wěn)定性,調(diào)節(jié)有關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)量等。Cho等[34]利用 DNA shuffling連續(xù)循環(huán)得到了提高有機(jī)磷酸酯水解酶活性的變異株E.coli 22A11,產(chǎn)生的水解酶降解速率比野生型快25倍。Ensley等[35]通過(guò)基因工程手段增加編碼基因的翻譯來(lái)提升限速酶和調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)水平,使得改造后的大腸桿菌氧化萘的速度可以達(dá)到 5.0 g/L·h。
組成型酶高度的底物特異性使微生物不能有效代謝很多硝基-芳香烴,體外蛋白質(zhì)工程可通過(guò)定向修飾來(lái)改變酶降解底物的動(dòng)力學(xué)。如,改變細(xì)胞色素P450活性位點(diǎn)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),使其能結(jié)合鹵代脫氫酶,并影響芳烴加雙氧酶的底物范圍,由此構(gòu)建的改造菌株能夠降解目標(biāo)硝基芳烴和其他有毒污染物,應(yīng)用于含有毒化學(xué)物的工業(yè)廢水的處理[36]。
NAC不能被有的微生物完全礦化,但經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后的終端產(chǎn)物可作為其他微生物的底物。因此,結(jié)合兩種供體菌株的基因,構(gòu)建代謝途徑銜接、互補(bǔ)的高效工程菌株可使NAC達(dá)到有效礦化。鞘氨醇單胞菌UG30中pcp-B基因編碼五氯苯酚降解酶,該基因在E.coli中異源表達(dá),能夠加速4-硝基鄰苯二酚的降解并在降解p-硝基酚時(shí)形成少量亞硝酸[37]。因此,結(jié)合不同代謝途徑能夠創(chuàng)造作用更寬范圍的NAC降解微生物。
質(zhì)??蓴y帶NAC降解相關(guān)的基因,介導(dǎo)微生物降解NAC,以質(zhì)粒為載體構(gòu)建工程菌株具有很大優(yōu)勢(shì)[38]。如,惡臭假單胞菌Paw中TOL質(zhì)粒,編碼NAC降解基因。Kadiyala等[39]構(gòu)建了兩種重組質(zhì)粒,分別攜帶有陰溝腸桿菌的硝基苯還原酶基因(nfs1)和假產(chǎn)堿假單胞菌JS45的硝基苯硝基還原酶基因(nbzA)及羥基苯胺變旋酶A(habA)基因,這兩種質(zhì)粒分別在大腸桿菌JS 995和JS 996中表達(dá),重組大腸桿菌能夠快速地將硝基苯轉(zhuǎn)化為對(duì)氨基苯酚。由55 kb傳遞性質(zhì)粒介導(dǎo)的不動(dòng)桿菌株RKJ12能以2-氯-4-對(duì)硝基甲酸作為單一碳/氮源和能源[40]。表2總結(jié)了可用于NAC降解的質(zhì)粒。目前,含有轉(zhuǎn)座插入lux基因的萘分解質(zhì)粒的熒光假單胞菌HK44突變體是美國(guó)第一個(gè)批準(zhǔn)野外測(cè)試的轉(zhuǎn)基因生物(GMO)[41]。
表2 不同種類(lèi)的硝基芳烴化合物降解質(zhì)粒Table 2 Different types of nitro-aromatic compounds degradation plasmids.
通過(guò)基因工程手段,將降解酶基因重組到目標(biāo)微生物中,可解決生物修復(fù)中遇到的各種問(wèn)題,在很大程度上提高降解效果,增強(qiáng)實(shí)際應(yīng)用的可行性。Cui等[46]發(fā)現(xiàn),在 E.coli中表達(dá)來(lái)源于鄰單胞菌M6的甲基對(duì)硫磷水解酶基因(mpd),可將NAC水解為p-硝基酚。用Burkholderia DNT的pJS1(包含2,4-二硝基甲苯基因簇)與苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)USDA 1936構(gòu)建微共生體,獲得的中華根瘤菌株DHK1能夠顯著降低污染土壤中的2,4-二硝基甲苯含量[28]。將洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)的甲苯單氧酶基因改造并導(dǎo)入熒光假單胞菌里,4 d即可清除小麥土壤微環(huán)境中63%的TCE[47]。盡管高效的基因工程微生物非常具有應(yīng)用前景,但成功的生物修復(fù)還需要對(duì)現(xiàn)場(chǎng)條件進(jìn)行評(píng)估。
目前,已對(duì)NAC微生物降解的多種途徑及其中間代謝產(chǎn)物的種類(lèi)進(jìn)行了廣泛研究,但是對(duì)其分解順序的分子基礎(chǔ)還需更全面透徹的了解。雖然已經(jīng)獲得了多種降解微生物資源,但對(duì)其特性及功能酶結(jié)構(gòu)、調(diào)控和分子生物學(xué)方面還需要更全面的理解。實(shí)際應(yīng)用中,由于污染物種類(lèi)繁多,更新變化較快,微生物在其中起到的作用也受到一定的限制,還需要開(kāi)發(fā)和發(fā)現(xiàn)新的微生物類(lèi)群,建立全面的操作性強(qiáng)的礦化技術(shù)。
在NAC微生物降解的研究中,重點(diǎn)將在以下方面展開(kāi)。①降解微生物的土壤定植情況的生態(tài)位鑒定,其中基因探針的方法是展開(kāi)監(jiān)測(cè)的有效手段。②在硝基芳香烴污染的生態(tài)系統(tǒng)中引入植物修復(fù),并與根基微生物相結(jié)合,這是一個(gè)可持續(xù)、生態(tài)友好、高效的根際修復(fù)過(guò)程。③探究超微細(xì)菌(ultramicrobacteria)種群從土層快速移除來(lái)消化有毒廢物的潛力,可為原位生物修復(fù)策略中存在的問(wèn)題提供了一種選擇指導(dǎo)。
NAC微生物降解在實(shí)際中還存在生物異源物質(zhì)的高極限濃度下處理酶的失活問(wèn)題、在生態(tài)系統(tǒng)中化合物的生物利用率問(wèn)題,及在比較苛刻的生化條件下降解微生物的存活問(wèn)題等,只有逐步解決這些問(wèn)題,微生物修復(fù)技術(shù)才可以更加有效。對(duì)于處理量的提高,優(yōu)化處理參數(shù)是有效的生物修復(fù)策略所必需的。在實(shí)際應(yīng)用中,仍然需要強(qiáng)調(diào)可持續(xù)生物修復(fù)的生態(tài)學(xué)原則。因此,探索新代謝途徑、簡(jiǎn)化天然進(jìn)化過(guò)程、改造出能凈化廣泛污染物種類(lèi)的微生物是科學(xué)家不懈追求的目標(biāo)。
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