張永紅， 唐芬芬， 邵榆嵐， 鐘 健， 白興榮

云南省農業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101

豬生長激素(porcine growth hormone/porcine somatotropin，pGH/pST)是豬腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的一種單一肽鏈蛋白質激素，在調節(jié)豬的生長發(fā)育方面起著重要作用，主要表現(xiàn)在降低脂肪含量、促進蛋白質合成和增加動物泌乳量，是畜牧業(yè)生產中極其重要的激素之一［1］。隨著人類日益增長的消費需求，利用基因工程技術表達豬生長激素應用于養(yǎng)豬業(yè)，可提高豬生長速度、緩解養(yǎng)殖產業(yè)的壓力、滿足消費市場對豬肉的需求，產生重大的經濟效益。本文主要綜述了豬生長激素的基因結構、生理功能及其重組蛋白表達研究的進展，并展望了重組豬生長激素的應用和發(fā)展前景。

1 豬生長激素的概述

豬生長激素是一類多肽類激素，由191個氨基酸組成，分子量22 kDa，等電點為6。豬基因組中GH基因為單拷貝，且無其他相似序列，其基因全長為2 231 bp，由5個外顯子和4個內含子構成，其外顯子長度分別是 10 bp、161 bp、117 bp、162 bp和 198 bp，內含子長度分別為 242 bp、210 bp、197 bp 和 278 bp;編碼成熟肽的片段大小為570 bp。

GH作為動物生長發(fā)育關鍵的激素，其基因序列在各物種中高度保守［2］，pGH與人(hGH)、牛(bGH)、鼠(mGH)生長激素的核苷酸序列具有高度同源性。pGH同bGH基因的5'端、3'端UTR及polyA+下游序列高度保守，據此說明它們可能以某種相同的方式來調節(jié)GH的合成，可推測GH作為代謝關鍵激素在物種進化過程中基因序列仍然高度保守。pGH蛋白的三維結構已經獲得解析(圖1A)［4］，X射線晶體結構分析表明，與bGH(圖1B)極為相似的是都含有4個α螺旋［3］。

圖1 GH 的蛋白質結構［3，4］Fig.1 Structure of growth hormone［3，4］.

2 豬生長激素的生理功能

生長激素是脊椎動物腦垂體分泌的多肽類激素，是動物調節(jié)生長和組織發(fā)育必不可少的激素，缺乏該激素機體就會停止生長，它與下丘腦分泌的促生長激素釋放因子、抑制素、類胰島素樣生長因子和胰島素等體內激素形成刺激和反饋機制，共同影響動物各類型組織的生理代謝。豬生長激素生理功能主要表現(xiàn)在以下幾個方面。

2.1 降低脂肪含量

pGH能使豬背膘的厚度和胴體脂肪含量明顯降低［5］。注射pGH能減弱脂肪合成、抑制脂肪合成酶活性，直接作用于脂代謝中關鍵酶乙酰輔酶A使其活性和mRNA含量分別下降58% 和 40%［6］。

2.2 提高蛋白質合成量

生長激素通過增加氮存留、氨基酸吸收、蛋白質合成的氨基酸摻入，以及作用于RNA聚合酶，調節(jié)轉錄來促進蛋白質合成。注射pGH以后，豬胴體品質有很大變化，表現(xiàn)為組織蛋白含量增加，瘦肉率提高。GH與抗胰島素表現(xiàn)為拮抗效應，葡萄糖需求減少，進而合成更多的蛋白質。它能調節(jié)葡萄糖和游離脂肪酸兩種關鍵代謝物不可逆轉的流失和氧化，短時間內提高乳汁分泌量，也可減少氮流失而提高蛋白質合成率［7］。

2.3 對類胰島素樣生長因子、胰島素分泌及葡萄糖濃度的影響

Donkin等［8］研究發(fā)現(xiàn)，注射pGH能使豬血清中類胰島素樣生長因子IGF-I/II和胰島素的水平提高，而且血漿中葡萄糖含量明顯提高。重組pGH蛋白注射到動物體內能加快本體生長激素和IGF-I循環(huán)水平，促進肝臟中IGF-I mRNA水平升高。

2.4 對不同生長階段豬個體的影響

長期注射豬生長激素對哺乳仔豬(到第28 d斷奶的哺乳豬)［9］、小豬(體重 10 kg 左右)［10］、生長豬［11］、后備母豬［12］和哺乳母豬都能明顯提高體重，而且哺乳母豬泌乳量也有較大提高［13］。

2.5 對礦物質代謝的影響

pGH能促進鈣、磷、鎂等礦物質元素的吸收，但礦物質元素在血漿中的濃度不發(fā)生變化［14］。Caperna等［14］發(fā)現(xiàn)pGH可增強Fe元素在體內的滯留，并促進其吸收。

3 重組豬生長激素的表達

pGH最早是直接從豬腦組織中提取獲得，而采用簡單的化學方法從豬垂體中提取pGH，大量豬個體腦垂體只能得到微量pGH，存在回收量和回收率低等問題，極大限制了pGH的應用。借助基因工程技術表達pGH能夠克服上述缺點，使pGH在生產上應用成為可能。

自20世紀80年代起，有關pGH的克隆研究逐步深入。Seeburg等［15］用基因文庫的方法克隆了pGH的非全長基因;繼而，Vize等［2］利用含pGH基因全長cDNA序列作為雜交探針確定了該基因的全序列。我國在國外pGH研究的基礎上，也進行了一些探索。王華巖等［16］克隆得到了含5'端和3'端UTR的pGH全長cDNA;齊順章等［17］對pGH cDNA全基因序列進行了測定分析;楊青等［18］從構建的豬腦垂體基因文庫中篩選到了pGH基因并成功克隆了該基因。Evock等［19］最先通過原核表達技術表達豬生長激素，而且具有促生長生物活性。目前的研究集中在利用原核或真核表達系統(tǒng)高效表達有活性的重組pGH上。

3.1 pGH基因的原核表達

pGH原核生物表達系統(tǒng)通常以大腸桿菌作為受體，技術成熟、操作簡便，且大腸桿菌繁殖周期短、外源蛋白表達量高。但原核表達系統(tǒng)也存在明顯缺點限制其應用，主要體現(xiàn)在:①原核其表達的pGH形成會包涵體，而不能分泌到培養(yǎng)基上清中，提取蛋白質首先必須首先破碎細胞獲得包涵體，然后利用強變性劑來溶解包涵體使pGH蛋白變性，最后變性蛋白通過復性才能得到活性蛋白，包涵體雖有益于抵御蛋白酶降解，但不利于蛋白質的分離純化。②原核表達蛋白無翻譯后的修飾，并且從包涵體制備的外源蛋白可能無生物活性，pGH基因的表達序列長度(ORF序列、成熟肽片段等)也影響蛋白質的活性。③原核重組表達系統(tǒng)遺傳穩(wěn)定性差，需要選擇合適的表達載體來表達目的蛋白質，還需優(yōu)化誘導溫度、誘導因子等。解決上述問題，pGH原核表達才能成功應用。最新研究證實，注射原核表達的重組pGH蛋白的日本微型豬表現(xiàn)出促生長效果［20］。

3.2 pGH基因的真核表達

3.2.1 哺乳動物細胞表達pGH pGH在哺乳動物、魚類中已經成功得到表達并具有生物效應，考慮到哺乳動物細胞表達的產物在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近天然蛋白質分子，用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)來表達pGH，可為pGH蛋白的生產應用提供依據。

脂質體載體和病毒載體常用于哺乳動物細胞的轉染。1990年，Kato等［21］利用哺乳動物猴COS-1細胞成功表達了pGH，重組pGH蛋白同天然pGH蛋白分子大小一致。2007年，Zuhorn等［22］發(fā)現(xiàn)陽離子脂質體(CLS)能克服細胞障礙將表達載體成功轉染到細胞內表達目的基因。2011年，Peng等［23］利用CLS介導的含 pGH 基因載體在COS-7真核細胞內表達pGH蛋白和小鼠體內表達pGH，小鼠體重發(fā)生顯著變化。陳斌方等［24］用帶有pGH cDNA的核糖體進入位點介導的雙順反子并帶有新霉素抗性標記的逆轉錄病毒載體pSN-pGH轉染鼠胚胎成纖維細胞，將感染的細胞通過腹膜注射到同系的去垂體小鼠體內，發(fā)現(xiàn)感染細胞分泌表達的pGH具有生物活性，植入15～57 d后小鼠脛骨有明顯的促生長效應;G418處理小鼠發(fā)現(xiàn)植入的成纖維細胞70 d還有存留，隨著小鼠生長，轉染細胞減少而pGH mRNA水平降低，但pGH轉錄水平并不降低。采用病毒載體轉染細胞植入動物體內能夠表達有促生長效應的活性蛋白，但表達水平受pGH cDNA拷貝數的限制。利用不帶任何篩選標記的逆轉錄病毒載體將pGH cDNA轉入鼠成纖維細胞NIH373中表達，并將帶有新霉素篩選標記的pGH反病毒載體二次感染處理NIH373細胞，結果發(fā)現(xiàn)增加宿主染色體前病毒中pGH DNA的拷貝數增加，進而增加氮端發(fā)生修飾的pGH的分泌量也有所增加［25］。

利用哺乳動物細胞系來表達pGH，表達的重組蛋白具有翻譯后的修飾并表現(xiàn)天然的生物活性，但應用何種哺乳動物細胞系表達都存在細胞凋亡、表達調控原件的優(yōu)化等問題，細胞培養(yǎng)成本較高并且篩選標記不明顯，加之目的蛋白收獲量較低，很難投入生產，因此需要探索新的蛋白質表達技術。

3.2.2 酵母表達pGH 酵母表達的外源蛋白存在翻譯后的加工修飾，酵母兼具大腸桿菌異源蛋白表達量高的優(yōu)點，因此酵母已成為基因工程技術中重要的表達系統(tǒng)。Jo等［26］根據已報道的pGH基因編碼序列，通過優(yōu)化密碼子在酵母細胞中成功表達了pGH，其大小為22 kDa，并占胞內可溶蛋白10%，獲得的重組pGH同樣具有改變豬生長速率的生物活性。但是酵母表達系統(tǒng)同樣存在表達蛋白內部降解、信號肽加工不完全、表達產物過度糖基化等不足，需要在實際應用中不斷改進。

3.2.3 昆蟲表達pGH 桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(baculovirus expression vector system，BEVS)，也稱作昆蟲表達系統(tǒng)，于20世紀80年代構建并開始廣泛應用，是一種功能全面的真核細胞基因表達載體系統(tǒng)，具有多角體啟動子控制下的高效表達、真核細胞完善的轉譯后加工修飾、較易從細胞培養(yǎng)上清中和昆蟲組織中純化目的蛋白等優(yōu)點。

當前，已有數千計的異源基因在該系統(tǒng)中得到表達，且產生的重組蛋白可進行精確的蛋白質折疊、糖基化、信號肽切割等翻譯后加工修飾;并且基因加入信號肽后，表達產物有較強的胞外分泌能力，有利于產物的后加工，并且重組體的遺傳穩(wěn)定性好［27］，BEVS在上述方面明顯優(yōu)于原核表達載體系統(tǒng)。歐陽菁等［28］利用BEVS在昆蟲細胞中表達了pGH基因，選擇帶病毒polh基因啟動子和gp67信號肽的重組pGP67-pGH轉移載體，與致死缺陷型線性化AcMNPV-OCC-DNA共轉染草地夜蛾細胞(Sf9)，構建了既能形成多角體又能表達外源基因的苜蓿丫紋夜蛾核多角體重組病毒AcMNPV-pGP67-pGH-OCC+，SDS-PAGE 和 Western雜交檢測到感染重組病毒的Hi5細胞上清液可溶蛋白中22 kDa的豬生長激素條帶，pGH蛋白占細胞可溶蛋白的4.48%。雖然桿狀病毒表達系統(tǒng)表達蛋白可完成翻譯后的修飾并且表達量相對較高，但該系統(tǒng)還具有病毒增殖周期較短，目的蛋白無法連續(xù)表達的缺點，并且病毒基因表達調控機制尚不清楚，各病毒株系之間毒力還存在差異，毒力的大小和增殖直接影響蛋白質的表達量，需要進一步深入研究。

家蠶是迄今為止被人類完全馴化并得以充分利用的重要經濟昆蟲之一，具有易飼養(yǎng)、繁殖周期短、繁殖數量大等特點。在基因工程領域，作為重要的模式生物，家蠶的遺傳背景清楚，研究深入。家蠶表達外源基因具有簡單、成本低廉、安全等優(yōu)點，以家蠶生物作為反應器可低成本、大規(guī)模生產重組蛋白，是一種重要的昆蟲表達系統(tǒng)，目前已得到廣泛的開發(fā)與應用。家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)被廣泛用于家蠶生物反應器研究中，朱江等［29］將帶有6×His純化標簽的 pGH基因片段連接到pBacPAK構建成重組穿梭載體pPGH030，重組載體同Bm-BacPAK6共轉染BmN細胞，細胞破碎后的上清溶液中可檢測到pGH蛋白表達;BmN細胞上清液接種5齡家蠶和蠶蛹，幼蟲和蛹血淋巴中均檢測到分子量約25 kDa的特異pGH蛋白質條帶，證實pGH在家蠶細胞和蠶體中得到了表達。與昆蟲培養(yǎng)細胞相比，利用家蠶幼蟲和蛹生產pGH能夠獲得更高的表達量，同時還可開發(fā)為含有pGH蛋白的新型昆蟲飼料。

利用家蠶BmNPV表達系統(tǒng)生產重組蛋白時，存在家蠶批次病毒接種的問題，并且后續(xù)蛋白分離純化相對繁瑣。因此，對家蠶反應器表達重組蛋白的大量研究集中在改進轉基因方法，以及如何提高蛋白表達量和易于分離純化蛋白上。家蠶個體表達重組蛋白pGH的后續(xù)分離純化較為困難，而采用家蠶特異組織(絲腺、脂肪體等)在特定時期表達pGH，可提高其表達量并彌補個體表達的不足。家蠶幼蟲的絲腺作為合成和分泌絲蛋白的器官，5齡后期絲膠和絲心蛋白大量合成，若利用相應的絲膠和絲素啟動子來驅動pGH的表達，不僅利于純化目的蛋白，而且表達量大為提高［30］。家蠶組織特異性表達基因的啟動子也逐漸被克隆，如30k蛋白家族中的lp3基因啟動子，在家蠶脂肪體和血液中特異表達［31］，還有中腸特異表達啟動子［32］等。而家蠶組成型啟動子如A3［33］、熱激蛋白 HSP 啟動子［34］在家蠶的各個組織盡有表達，不存在時期特異性，應用這類啟動子則方便純化蛋白且目的蛋白表達量也相對較高。為了增強啟動子的驅動活性，也可以在啟動子的上游插入增強子片段使目的蛋白表達量增大。目前家蠶轉基因技術相對成熟，已經建立各種轉基因載體，如，基于pigg Bac轉座子帶熒光篩選標記(GFP、DsRed)的轉基因家蠶，制作相對容易［35］。家蠶轉基因技術的研究對拓展家蠶生物反應器和促進pGH的生產化具有重要意義。

3.3 pGH轉基因動物研究

自1982年將pGH基因整合到小鼠基因組上首先實現(xiàn)陽性轉基因小鼠［36］，利用轉基因技術已經成功將 pGH 基因應用于豬［37］、兔子［38］等哺乳動物。評估重組pGH的功能需要測定轉基因動物體重和組織發(fā)育情況，確定pGH的促生長作用。1988年，Vize等［37］建立用人金屬硫蛋白啟動子驅動pGH表達的轉基因豬，陽性個體較陰性個體生長速率加快和體重有所增加;2003年，仲飛等［39］同樣使用綿羊鐵硫蛋白啟動子啟動pGH在小鼠體內表達促進了個體生長速率。實驗動物體重發(fā)生了明顯變化，但是潛在的風險還不得而知，為了克服簡單外源啟動子驅動GH表達的轉基因技術給動物個體產生的副作用，Jia等［40］運用BAC(細菌人工染色體)攜帶pGH基因，還包括正、負調控元件，選擇合適啟動子驅動pGH在小鼠體內表達，陽性小鼠在整個發(fā)育過程中未發(fā)現(xiàn)任何疾病癥狀。1998年，張志紅等［41］構建綿羊鐵硫蛋白啟動子啟動pGH的表達盒，將載體注射到金魚受精卵內表達pGH，金魚表達的重組pGH能使其體重明顯上升，證實pGH在魚類也同樣產生促生長的效果。

4 重組豬生長激素的應用與發(fā)展前景

開發(fā)重組豬生長激素具有重要的科研價值、經濟意義、社會意義和生態(tài)效益。動物微量注射pGH就能產生明顯的促生長效果，能夠提高豬對飼料的利用率，縮短肉豬的出欄時間，減少碳排放，緩解市場供需矛盾。但pGH的應用必須有嚴格的規(guī)范和監(jiān)管，一方面，過量注射或長期注射pGH會產生風險，甚至嚴重的副作用，如雌性牛個體生育率下降，可能完全不育，免疫力也低于未注射的個體［42］，而豬長期注射重組 pGH蛋白的潛在問題還未評估。另一方面，由于正常動物個體自身合成分泌的生長激素足以維持正常的生長發(fā)育，因此利用通過轉基因技術在動物體內過量表達同源或外源GH進行生產性應用，則必須嚴格評估其安全性。

使用重組pGH促進肉豬生長的同時保持豬個體的健康是今后生產應用的重要方向。重組pGH蛋白與固醇類激素、人工合成的生長調節(jié)激素不同，不會長時間在動物體內殘留，因此不存在pGH在動物體內積累的問題。人食用注射pGH的豬或轉pGH基因的豬，因pGH半衰期較短、種間異性，不與hGH受體結合產生生理效應，短時間內對人體不會產生危害，但是目前還沒有充分的證據證明pGH對人體無潛在且長遠的影響，因此還需嚴格評估。盡管重組pGH應用于養(yǎng)豬業(yè)仍存在分歧，但是相對于傳統(tǒng)生長調節(jié)激素，在動物毒性、動物殘留和對人體的影響等方面，已經具有明顯的比較優(yōu)勢。通過基因工程技術優(yōu)化，清楚探索該激素作用機制，重組豬生長激素同樣能夠應用于生產。通過優(yōu)化pGH基因的翻譯序列、引入其基因內含子序列、選擇優(yōu)異的啟動子等手段使得重組pGH蛋白更接近天然結構;清楚了解pGH的代謝機理，研究如何在生豬飼養(yǎng)過程中合理、規(guī)范使用pGH蛋白，可將pGH蛋白質運用于養(yǎng)豬業(yè)以生產更加健康的豬。不同區(qū)域的豬在瘦肉率、口感、生長速度等性狀上都存在差異，運用傳統(tǒng)的育種手段，還存在生殖隔離、選育周期較長等問題，若將pGH用于經濟性狀較好的豬品種，該品種豬可實現(xiàn)瘦肉率高、生長較快等傳統(tǒng)育種的目標，可解決傳統(tǒng)遺傳育種遇到的上述問題。

利用經濟昆蟲家蠶來表達豬生長激素，可充分合理利用家蠶資源，繭殼產生其經濟價值外，蛹和蛾還可以開發(fā)含pGHz的新型飼料添加劑，無需提取純化pGH蛋白即可直接應用，節(jié)省pGH蛋白的生產成本，這也是目前頗具生產前景的研究方向。

隨著人口增加，人們對物質生活要求的提高，養(yǎng)豬業(yè)飼料成本上漲、占生產成本比重增大，pGH的使用有助于緩解上述矛盾。重組pGH蛋白質并不隨著豬的生長在豬體內殘留，在經基因工程技術優(yōu)化以后，pGH能為廣大消費者提供相對廉價、瘦肉率高、更健康的豬，產生重大的社會效益，因此，研究開發(fā)重組豬生長激素、實現(xiàn)重組豬生長激素蛋白生產化具有廣闊的發(fā)展前景。

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