張繼紅,范衛(wèi)

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電針百會、足三里穴對睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

張繼紅,范衛(wèi)

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院,上海 201508)

觀察電針百會、足三里穴對睡眠剝奪(SD)后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響以及腦干中多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)含量的變化。將32只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、睡眠剝奪組、假針組和電針組。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)分別在連續(xù)5 d的睡眠剝奪前后測試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,并應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)和電化學(xué)檢測器檢測大鼠腦干中DA和5-HT含量。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,睡眠剝奪組和假針組的潛伏期均高于正常組和電針組(＜0.05);睡眠剝奪組和假針組的平臺象限滯留時(shí)間均低于正常組和電針組(＜0.05),電針組低于正常組(＜0.05)。在避暗實(shí)驗(yàn)中,連續(xù)5 d的睡眠剝奪后睡眠剝奪組、假針組和電針組的步入潛伏期均低于正常組(＜0.05),而電針組高于睡眠剝奪組和假針組(＜0.05)。連續(xù)5 d的睡眠剝奪后,睡眠剝奪組和假針組大鼠腦干DA含量均低于正常組和電針組(＜0.05),電針組低于正常組(＜0.05);睡眠剝奪組和假針組大鼠腦干5-HT含量均高于正常組和電針組(＜0.05),電針組高于正常組(＜0.05)。電針可明顯改善睡眠剝奪后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,其機(jī)制可能與腦干中DA和5-HT含量的變化有關(guān)。

針刺療法;電針;睡眠剝奪;多巴胺;5-羥色胺;大鼠;學(xué)習(xí)記憶

睡眠是機(jī)體進(jìn)行自我修復(fù)的重要過程,生命大約三分之一的時(shí)間是在睡眠中度過的。隨著社會和科技的發(fā)展,當(dāng)前人們的生活節(jié)奏越來越快,“熬夜”逐漸成為各年齡層的生活習(xí)慣,而且睡眠時(shí)間和睡眠規(guī)律也呈現(xiàn)紊亂,這將會影響整個(gè)機(jī)體的機(jī)能。早期的研究已經(jīng)證實(shí)一定時(shí)間的睡眠剝奪可導(dǎo)致記憶力下降[1],因此由睡眠問題導(dǎo)致的記憶障礙逐漸引起人們的關(guān)注。從延髓至中腦的腦干中,存在著調(diào)節(jié)睡眠與覺醒的腦中樞。1949年意大利著名電生理學(xué)家馬魯吉和馬貢發(fā)現(xiàn),電刺激腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可引起動(dòng)物的覺醒反應(yīng)。此后大量實(shí)驗(yàn)研究表明,無論是各種外部刺激還是感覺通路的電刺激,均沿傳入通路的側(cè)支引起腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的興奮,然后再引起大腦皮層廣泛區(qū)域的覺醒反應(yīng)。因此,把腦干上部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稱為上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng), 上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)正?；顒?dòng)可維持大腦皮質(zhì)的清醒狀態(tài)。

針刺是中醫(yī)學(xué)特色的治療方法,通過針刺腧穴達(dá)到調(diào)節(jié)臟腑,引暢氣血的功能。百會穴為百脈之會,貫達(dá)全身,是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴,常與足三里、三陰交等穴配合,具有醒腦開竅、安神定志等功能[2]。足三里穴為足陽明胃經(jīng)的要穴之一,具有調(diào)理脾胃、補(bǔ)中益氣、通經(jīng)活絡(luò)等功能,在神經(jīng)系統(tǒng)主要促進(jìn)腦細(xì)胞機(jī)能恢復(fù)。筆者通過電針百會、足三里穴觀察其對睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

清潔級SD大鼠32只,雄性,體質(zhì)量為(250±20) g,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中,室溫控制在(22±1)℃,自由攝食和飲水,在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1星期后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。對動(dòng)物的處理均符合國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用準(zhǔn)則。動(dòng)物分為正常組、睡眠剝奪組、假針組和電針組,每組8只,其中睡眠剝奪組給予連續(xù)5 d(120 h)的睡眠剝奪;電針組在連續(xù)5 d的睡眠剝奪過程中每日給予30 min電針百會穴和足三里穴;假針組在連續(xù)5 d的睡眠剝奪過程中每天在百會穴和足三里穴位旁皮下給予針刺但不通電,且保持大鼠不睡眠;正常組不給予任何干預(yù)。

1.2 動(dòng)物模型的制備

采用小平臺水環(huán)境法[3]。根據(jù)文獻(xiàn)自制30 cm×30 cm×40 cm的鼠箱,其中有一直徑為6.3 cm、高8 cm的平臺,在平臺周圍注滿水,水溫保持在20℃,水面距平臺面約1.0 cm。睡眠剝奪的大鼠在小平臺上屈曲而立 ,在快動(dòng)眼睡眠時(shí),由于伴隨全身肌肉松弛和節(jié)律性垂頭,大鼠落入水中而驚醒,再爬上平臺。每日換水并清洗鼠箱。在大鼠活動(dòng)空間給予12 h/12 h明暗交替,室內(nèi)溫度控制在18～22℃。實(shí)驗(yàn)前,讓大鼠熟悉適應(yīng)環(huán)境1星期,然后放入裝置進(jìn)行連續(xù)5 d的睡眠剝奪。

1.3 電針方法

參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》選取百會穴和足三里穴,使用韓氏電針儀(LH-202 型),頻率為2 Hz,電流強(qiáng)度為1 mA,以大鼠頭部微顫為宜,持續(xù)30 min。電針于大鼠開始睡眠剝奪的第1天開始,每天上午9時(shí)開始給予30 min的電針并監(jiān)控大鼠不能睡覺,連續(xù)給予電針5 d。

1.4 避暗實(shí)驗(yàn)

先將大鼠放入明室,明/暗兩室之間的門洞敞開,讓動(dòng)物在兩室內(nèi)自由活動(dòng)2～3 min,取出后放回飼養(yǎng)籠。第2天,將大鼠放入明室,當(dāng)它進(jìn)入暗室后將其關(guān)閉在暗室中接受0.8 mA的足底電擊而不能逃避。24 h后再次將大鼠放入明室,進(jìn)行測試記錄動(dòng)物進(jìn)入暗室的潛伏期,為步入潛伏期[4]。

1.5 Morris水迷宮測試

Morris水迷宮測試分為兩個(gè)階段。①定位航行試驗(yàn),即試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行4 d,每天大鼠連續(xù)測試4次,分別從1、2、3、4這4個(gè)象限入水,入水時(shí)動(dòng)物面向池壁,記錄其從入水開始至找到平臺這段時(shí)間內(nèi)大鼠的軌跡和時(shí)間。②空間探索試驗(yàn),即第5天撤走平臺,任選1個(gè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中,游泳時(shí)間均為60 s,記錄大鼠在平臺所在象限滯留時(shí)間和找到平臺的潛伏期,以此作為空間記憶力的成績。

1.6 腦干DA和5-HT的含量測定

睡眠剝奪及行為學(xué)測試結(jié)束后即刻處死大鼠,立即取腦冰上分離腦干,液氮速凍后移入-80℃保存。采用高效液相色譜和電化學(xué)檢測器檢測腦干DA和5-HT的含量。測定時(shí)將腦干稱重后加入9倍體積的甲醇,冰浴下勻漿,離心后取上清測定。色譜條件分為,固定相為AQ-C18色譜柱;流動(dòng)相為乙腈/水=7/93,流速0.5 mL/min,進(jìn)樣量10mL。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析(),以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 睡眠剝奪后大鼠一般狀況和行為變化

睡眠剝奪5 d后大鼠的一般狀況表現(xiàn)為疲憊不堪、皮毛蓬亂、無光澤,尾巴和爪子有損傷。睡眠剝奪5 d行為變化尤其明顯,表現(xiàn)為大鼠興奮性提高,探究行為和攻擊性增強(qiáng),對環(huán)境刺激的警覺性、反應(yīng)性及進(jìn)攻行為也增強(qiáng)。

2.2 大鼠學(xué)習(xí)記憶測定

2.2.1 4組大鼠睡眠剝奪前后避暗實(shí)驗(yàn)步入潛伏期比較

表1 4組大鼠睡眠剝奪前后避暗實(shí)驗(yàn)步入潛伏期比較 (±s,s)

注:與正常組比較1)＜0.05;與睡眠剝奪組比較2)＜0.05;與假針組比較3)＜0.05

睡眠剝奪前各組大鼠步入潛伏期比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。在連續(xù)5 d的睡眠剝奪后,大鼠避暗實(shí)驗(yàn)的步入潛伏期發(fā)生變化。睡眠剝奪組、假針組、電針組大鼠睡眠剝奪后避暗實(shí)驗(yàn)步入潛伏期與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。假針組、電針組睡眠剝奪后避暗實(shí)驗(yàn)步入潛伏期與睡眠剝奪組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。電針組睡眠剝奪后避暗實(shí)驗(yàn)步入潛伏期與假針組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。

2.2.2 4組大鼠睡眠剝奪前后Morris水迷宮測試比較

Morris水迷宮測試主要觀察大鼠放入迷宮到第1次找到平臺位置的潛伏期和60 s測試時(shí)間內(nèi)滯留在平臺所在象限的滯留時(shí)間。由表2可見,4組大鼠睡眠剝奪前Morris水迷宮測試潛伏期比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。睡眠剝奪組和假針組大鼠睡眠剝奪后Morris水迷宮測試潛伏期與正常組和電針組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。

表2 4組大鼠睡眠剝奪前后Morris水迷宮測試潛伏期比較 (±s,s)

注:與正常組比較1)＜0.05;與假針組比較2)＜0.05

由表3可見,4組睡眠剝奪前Morris水迷宮測試平臺象限滯留時(shí)間比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。睡眠剝奪組、假針組、電針組睡眠剝奪后Morris水迷宮測試平臺象限滯留時(shí)間與正常組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。電針組大鼠睡眠剝奪后Morris水迷宮測試平臺象限滯留時(shí)間與睡眠剝奪組和假針組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。

表3 4組大鼠睡眠剝奪前后Morris水迷宮測試平臺象限滯留時(shí)間比較 (±s,s)

注:與正常組比較1)＜0.05;與睡眠剝奪組比較2)＜0.05;與假針組比較3)＜0.05

2.3 4組大鼠睡眠剝奪后腦干DA和5-HT含量比較

表4 4組大鼠睡眠剝奪后腦干DA和5-HT含量比較 (±s,ng/mg)

注:與正常組比較1)＜0.05;與睡眠剝奪組比較2)＜0.05;與假針組比較3)＜0.05

由表4可見,睡眠剝奪組、假針組、電針組大鼠睡眠剝奪后腦干DA和5-HT含量與正常組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。電針組大鼠睡眠剝奪后腦干DA和5-HT含量與睡眠剝奪組和假針組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。

3 討論

睡眠剝奪是由于某些原因?qū)е碌乃邤?shù)量被迫減少而產(chǎn)生的一種特殊的心理生理狀態(tài)。長期睡眠障礙可導(dǎo)致腦功能紊亂,表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力減退和其他復(fù)雜的神經(jīng)生理與生化改變[5]。睡眠剝奪是研究睡眠的重要方法,采用小平臺水環(huán)境法制作大鼠睡眠剝奪模型,應(yīng)用此法時(shí)大鼠尚能進(jìn)行慢波睡眠,因此剝奪的主要是快波睡眠(異相睡眠),其對學(xué)習(xí)和記憶的影響更大[6]。本研究采用避暗實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)兩種方法觀測大鼠在連續(xù)5 d睡眠剝奪的情況下其學(xué)習(xí)記憶能力的變化,結(jié)果與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的相一致,均出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力的下降。

目前關(guān)于睡眠剝奪導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶受損的機(jī)制研究主要集中于睡眠剝奪可導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)紊亂、誘導(dǎo)異常基因的表達(dá)以及引起腦內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能平衡失調(diào)等方面。其中睡眠剝奪所致腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)紊亂失衡是非常重要的一個(gè)原因。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT神經(jīng)元,主要分布在腦干中縫附近的狹窄區(qū)域內(nèi)——中縫核及其附近網(wǎng)狀結(jié)核內(nèi),是腦內(nèi)合成5-HT的主要部位。中縫向上的纖維叫做5-羥色胺能上行通路,與下丘腦、邊緣系統(tǒng)以及大腦皮層發(fā)生聯(lián)系,參與維持醒覺、睡眠、情緒等活動(dòng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),在睡眠剝奪前期,機(jī)體能通過增加單胺氧化酶活性加快 5-HT 轉(zhuǎn)化為5-羥吲哚乙酸,以減少 5-HT 在腦內(nèi)的積累,達(dá)到維持清醒的目的。但隨著睡眠剝奪時(shí)間的延長,單胺氧化酶的活性降低,轉(zhuǎn)化作用減弱5-HT 在腦干、下丘腦等蓄積,機(jī)體產(chǎn)生更加嚴(yán)重的疲勞感。此外,長時(shí)間睡眠剝奪后,突觸前膜 5-HT 受體敏感性下降,對 5-HT 的再攝取減少,同時(shí) 5-HT 合成增加,機(jī)體內(nèi) 5-HT 水平增高,出現(xiàn)疲勞感和睡意[7-8]。在本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過120 h睡眠剝奪的大鼠腦干中 5-HT 含量顯著升高,可能是由于單胺氧化酶的活性低,導(dǎo)致 5-HT 的集聚。

DA作為中樞的神經(jīng)遞質(zhì)之一,主要負(fù)責(zé)興奮的傳遞,也與上癮有關(guān)。人腦中多巴胺能神經(jīng)元總數(shù)約為40萬,廣泛投射到端腦、間腦、腦干和脊髓,其中中腦的多巴胺能神經(jīng)元投射到腦干和脊髓形成下丘脊髓束,可參與調(diào)節(jié)腦干網(wǎng)狀系統(tǒng)的狀態(tài)。DA對神經(jīng)系統(tǒng)有興奮作用,隨著睡眠剝奪的進(jìn)行,中樞疲勞的出現(xiàn),中樞中 DA 含量逐漸減少。近來的一些研究證實(shí),多巴胺可以與去甲腎上腺素受體相互作用后,抑制中樞的去甲腎上腺素,尤其是腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的去甲腎上腺素系統(tǒng)[9-10]。其他研究表明,被剝奪快眼睡眠的動(dòng)物前額皮質(zhì)中 DA 含量下降而NE 水平升高。本研究中,睡眠剝奪后的各組大鼠腦干中 DA 下降,可能是其認(rèn)知功能下降的重要因素。研究表明睡眠剝奪后,精神認(rèn)知行為會出現(xiàn)一定的抑制趨勢,這可能與5-HT在下丘腦和腦干的過度堆積有關(guān),大鼠的行為興奮性又與DA釋放呈正相關(guān)[11]。因此,我們推測在睡眠剝奪后大鼠的精神認(rèn)知行為表現(xiàn)可能受5-HT和DA這一對神經(jīng)遞質(zhì)在腦內(nèi)尤其是在下丘腦和腦干中的平衡相關(guān),這也是我們以腦干中5-HT和DA濃度變化評價(jià)電針作用效果的原因。

本結(jié)果顯示,電針大鼠的百會穴和足三里穴后,可改善睡眠剝奪后大鼠在避暗測試和水迷宮測試中的學(xué)習(xí)記憶能力,提示電針百會穴和足三里穴所產(chǎn)生的開竅醒腦、健腦益智的作用在睡眠剝奪狀態(tài)中也可顯現(xiàn)。

傳統(tǒng)中醫(yī)文獻(xiàn)中未見到直接對睡眠剝奪的記載,但多認(rèn)為其與“虛勞”、“郁證”相類似,多因積勞內(nèi)傷等引起的陰陽失調(diào)、氣血失和。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有研究認(rèn)為電針可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能,包括神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的平衡[12-13]。從本研究的結(jié)果可以看出經(jīng)電針干預(yù)后睡眠剝奪大鼠的腦干5-HT有所下降而DA濃度有所升高(相對于睡眠剝奪組和假針組),從而使由睡眠剝奪引起的5-HT和DA濃度變化趨向于正常水平,但是電針如何調(diào)節(jié)腦干中5-HT和DA濃度變化,以及如何使得睡眠剝奪后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善仍是我們下一步研究的重點(diǎn)。

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Effect of Electroacupuncture at Baihui and Zusanli on Learning and Memory in Rats with Sleep Deprivation

-,.

,201508,

o investigate the effect of electroacupuncture at baihui and Zusanli on learning and memory, and changes in the dopamin (DA) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) contents of the brainstem in rats with sleep deprivation (SD).Thirty-two male SD rats were randomly allocated to normal, sleep deprivation, sham acupuncture and electroacupuncture groups. Rat learning and memory abilities were tested using the Morris water maze and the dark avoidance test before and after five consecutive days of sleep deprivation. The DA and 5-HT contents of rat brainstem were measured by high performance liquid chromatography (HPLC) and electrochemical detection.In Morris water maze experiment, the latency was longer and time spent in the platform quadrant was shorter in the sleep deprivation and sham acupuncture groups than in the normal and electroacupuncture groups (both＜0.05). Time spent in the platform quadrant was shorter in the electroacupuncture group than in the normal group (＜0.05). In the dark avoidance test, step-through latency was shorter in the sleep deprivation, sham acupuncture and electroacupuncture groups than in the normal group (＜0.05) and longer in the electroacupuncture group than in the sleep deprivation and sham acupuncture groups (＜0.05) after five consecutive days of sleep deprivation. After five consecutive days of sleep deprivation, the DA content of rat brainstem was lower in the sleep deprivation and sham acupuncture groups than in the normal and electroacupuncture groups (＜0.05) and lower in the electroacupuncture group than in the normal group (＜0.05); the 5-HT content of rat brainstem was higher in the sleep deprivation and sham acupuncture groups than in the normal and electroacupuncture groups (＜0.05) and higher in the electroacupuncture group than in the normal group (＜0.05).Electroacupuncture can markedly improve learning and memory in rats with sleep deprivation. The mechanism may involve changes in the DA and 5-HT contents of the brainstem..

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Sleep deprivation; Dopamine; 5-hydroxytryptamine; Rats; Learning and memory

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.07.0676

1005-0957(2014)07-0676-04

張繼紅(1976 - ),女,主管技師

范衛(wèi)(1968 - ),女,副研究員,E-mail:weifan117@aliyun.com

2014-02-17