范金霞 王 瑤 王宏燕 張 玨

(東北農(nóng)業(yè)大學，哈爾濱，150030)

我國大興安嶺地區(qū)松針資源豐富，品種較多，而松針是松樹類植物的主要副產(chǎn)物之一，具有再生速度快、四季均可采收、天然蓄積量大的特點，而且松林區(qū)發(fā)生火災的危害極為嚴重。因此，積極研究開發(fā)并合理利用松針資源擁有重大意義。松針中纖維素類物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)高達56.4%［1］。纖維素占陸地生態(tài)系統(tǒng)生物量的80%，是地球上數(shù)量最大的可再生資源，每年通過全球生物合成可再生性纖維素達1 000億t以上［2］。對于降解纖維素的菌種目前研究較多的是霉菌，尤以綠色木霉、里氏木霉和康氏木霉為典型［3－4］，而對細菌的研究很少有報道。纖維素的生物降解研究表明［3］，單一微生物對纖維素的降解是很難完成的，或只能微弱進行，必須依靠兩種或兩種以上的微生物共同作用才能完成。

筆者從篩選降解松針纖維素的細菌菌株入手，篩選出酶活力性高而且降解纖維素快速的細菌。以松針粉末為主要碳源，結(jié)合菌株間的協(xié)同效應，用纖維素降解菌的單獨及混合發(fā)酵培養(yǎng)來考查菌株對松針纖維素的分解力，以便為這些菌株的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采集。從大興安嶺松林區(qū)采集腐殖土樣品，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

原料。大興安嶺林區(qū)的落葉松和云杉的松針，烘干后粉碎，過100目篩。

培養(yǎng)基。無機鹽篩選培養(yǎng)基:KH2PO40.5 g、(NH4)2SO40.4 g、MgSO4·7 H2O 0.07 g、CaCl20.07 g、CuSO40.005 g、ZnCl20.001 g、Na2HPO40.5 g、C6H6O620g;蛋白胨纖維素培養(yǎng)基(PCS):蛋白胨0.5 g、松針 0.5 g、NaCl 0.5 g、CaCO30.3 g、酵母浸粉 0.1 g;細菌培養(yǎng)基(LB):蛋白胨 5.0 g、NaCl 5.0 g、酵母浸粉2.5g;羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基:KH2PO40.5 g、(NH4)2SO40.4 g、MgSO4· 7 H2O 0.07 g、CaCl20.07 g、CuSO40.005 g、ZnCl20.001 g、Na2HPO40.5 g、CMC(羧甲基纖維素)—Na 15.0 g。

1.2 方法

1.2.1 富集和純化

將從菌源地采樣得來的土壤樣品取5 g加入到100 mL無機鹽培養(yǎng)基，激活菌源土中的菌種，28℃，轉(zhuǎn)速151 r/min搖床培養(yǎng)，重復傳接V代。將第V代菌液稀釋成一系列不同的稀釋度，取 10－4、10－5、10－63種稀釋度，涂布于無機鹽瓊脂培養(yǎng)基平板，每個稀釋度涂布3個平板，28℃恒溫培養(yǎng)長出菌群后，反復劃線分離至長出單菌落，鏡檢確定菌體為較純的單菌落后，接種于保藏培養(yǎng)基上保存。

1.2.2 纖維素降解細菌的初篩

將得到的細菌菌株分別用剛果染色法對平板篩選，其中平板5次重復，37℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h，每個平板倒入20 mL剛果紅溶液(質(zhì)量濃度1 g·L－1)，染色 30 min 后，再用 1 mol·L－1氯化鈉溶液洗滌2～3次，測量透明圈和菌體的直徑。選取兩比值較大的菌落進行下一步的單獨發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.3 纖維素降解細菌的復篩

纖維素分解菌的單獨與混合發(fā)酵培養(yǎng):取100 mL的錐形瓶，裝入50 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，并以體積比為5%的接種量接種，使其活菌數(shù)量達到1×109個/mL，于28℃、151 r/min的搖床震蕩培養(yǎng)，每隔24 h測量羧甲基纖維素酶活力。

粗酶液制備:取培養(yǎng)24h的發(fā)酵液10mL，在6 000 r·min－1條件下離心 10 min，所得上清液即為粗酶液。

羧甲基纖維素酶活力測定［5－6］:取 0.5%CMC—Na(溶于pH值5.0的醋酸—醋酸鈉緩沖液)2.0 mL，加入粗酶液1.0 mL。于50℃恒溫水浴保持30 min。取出加入 DNS試劑3.0 mL，于沸水浴中放置 10 min。冷卻后于540 nm處測定其吸光度值，按DNS法測定還原糖。纖維素酶活力的國際單位為1 mL酶底物反應液1 min內(nèi)產(chǎn)生相當于1 mg/L葡萄糖的還原糖量，即為1 U。

濾紙酶活力:將 0.03 g的濾紙浸入 1 mL 0.05 mol/L pH值5.0的醋酸—醋酸鈉緩沖液中，后加入1.0 mL適當稀釋的酶液，在50℃的水浴條件下反應60 min，加入3.0 mL DNS試劑終止反應，沸水浴中煮沸10 min，立即用冷水冷卻，于540 nm比色?？鄢敢汉偷孜锏目瞻缀?，通過標準曲線計算酶活力。

β－糖苷酶(β－Gase)活力:以 1.0 mL 0.5%的水楊素為底物(用0.05 mol/L pH值5.0的醋酸—醋酸鈉緩沖液配制)，其余同CMC。

微晶纖維素酶活力:1 mL的1%微晶纖維素溶液(用0.05 mol/L pH5.0 的檸檬酸緩沖溶液配制)，加入1.0 mL適當稀釋的酶液，于50℃反應120 min后，5 000 r/min離心10 min除去不溶物。然后取1.0 mL反應上清液用DNS法測定還原糖，即取1 mL反應上清液，加入 1 mL 0.05 mol/L pH=5.0 的醋酸—醋酸鈉緩沖液和3.0 mL DNS試劑，沸水浴中煮沸10 min，冷水冷卻后于540 nm比色。

2 結(jié)果與分析

2.1 富集和純化

從菌源土中取8個平行，進行36個小瓶的搖瓶篩選，其中1—10號瓶在28℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，11—26號瓶以151 r/min 28℃搖床培養(yǎng)，27—36號瓶在37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。每隔24 h測定纖維素酶活力。

經(jīng)實驗得知，測定1～6 d的纖維素酶活力，1—10號瓶總體在第3天的纖維素酶活力達到最高值，其中9號瓶的纖維素酶活力最高，為8.61 U;其次是3號瓶，達6.95 U。結(jié)果充分體現(xiàn)9號瓶與3號瓶中的纖維素降解菌群的酶活力相對較高，為篩選單獨菌種做理論基礎(chǔ)。而11—26號瓶在第4天時總體達到最高，其中第16號瓶中的微生物菌群的酶活力最高，達到20.10 U;11號與13號瓶的酶活力分別為1.18和 1.60 U，其酶活力要遠遠小于 16號瓶，可能因為菌群之間相互抑制的作用，或該部分菌群不適應這樣的發(fā)酵條件與發(fā)酵培養(yǎng)基。27—36號瓶中的菌群的纖維素酶活力經(jīng)實驗測得在第2天和第7天均出現(xiàn)峰值。

將篩選得出酶活力高的瓶進行菌落分離與純化，根據(jù)剛果紅透明圈直徑大小與菌落直徑的比值和該酶活力成正比的原理，經(jīng)羧甲基纖維素瓊脂平板與濾紙培養(yǎng)基初篩，篩出19株細菌，分別為a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s，結(jié)果見表 1。可知，a、b、d、h、r、o 6 株細菌水解圈比較大，可為下一步單獨發(fā)酵培養(yǎng)提供依據(jù)。

表1 培養(yǎng)24 h的不同細菌菌株的透明圈平均直徑

2.2 搖瓶篩選

2.2.1 菌株單獨發(fā)酵培養(yǎng)

將初篩得到的5株纖維素降解細菌接入到以松針粉為主要碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每24h測定羧甲基纖維素、微晶纖維素與濾紙酶活力。

由表2可知，篩選到的6株菌都具有一定的產(chǎn)纖維素酶能力，據(jù)文獻報道［7］羧甲基纖維素酶活力反映的是纖維素酶組分中內(nèi)切酶的活性。其中菌株h相對其他菌株酶活力最高，達21.06 U，其次是菌株 d，酶活力 19.35 U;菌株 r，酶活力 16.89 U;菌株b，酶活力 12.93 U。1～9 d，6 株菌均有兩個峰值，且第1個峰值高于第2個峰值。

表2 細菌單獨培養(yǎng)的羧甲基纖維素酶活力

實驗測得這幾株菌1～9 d的微晶纖維素酶活力均在第3天和第6天達到峰值，從表3可得出6株菌的纖維素酶活力都在90 U以上，其中菌株b最高，纖維素酶活力可達127.58 U;其次是菌株d，酶活力達121.80 U;再次是菌株h和r，酶活力分別為118.27 U和112.55 U。在達到第2個峰值后酶活力緩慢下降。

表3 細菌單獨培養(yǎng)的微晶纖維素酶活力

可以看出，6株濾紙的酶活力總體從第1天緩慢上升，然后在第3天均達到最高值，菌株r酶活力達66.46 U，菌株 d酶活力達62.77 U，菌株 h酶活力達52.93 U，菌株 b 酶活力 52.15 U，其中菌株 r的濾紙酶活力是6株菌中最高的。

表4 細菌單獨培養(yǎng)的濾紙酶活力

可以得出纖維素、微晶纖維素和濾紙酶活力均較高的 4 株菌，分別是菌株 b、d、h、r。

2.2.2 菌株混合發(fā)酵培養(yǎng)

將篩選出的4株菌b、d、h、r經(jīng)過24 h恒溫培養(yǎng)，分別以V(菌株)∶V(培養(yǎng)基)=1∶20的比例接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行2～4種混合培養(yǎng)，結(jié)果見表5—表8。可以看出，細菌菌株混合培養(yǎng)在一定程度上會提高酶活力。

從表5可以看出混合菌組合中菌株bdh組合的酶活力最高，達31.38 U，遠遠大于 b、d、h 3 株菌單獨培養(yǎng)的最高纖維素酶活力。菌株rd組合的酶活力相對較高，為29.19 U，僅僅低于組合bdh?？梢钥闯?，混合菌中菌株相互有促進作用，共同分泌纖維素酶達到高效分解纖維素的目的。

混合菌株組合的微晶纖維素酶活力見表6。1～9 d經(jīng)歷兩個峰值，第3天的峰值是最高的。菌株rd組合的微晶纖維素酶活力是最高的，為158.27 U，遠遠高于其他的組合;其次是菌株bdh組合，酶活力為150.41 U，其他組合基本都很平穩(wěn)，酶活力沒有太大的變化。

表6 混合菌株組合的微晶纖維素酶活力

混合菌組合的β－葡萄糖苷酶的酶活力見表7。菌株rd組合的β－葡萄糖苷酶酶活力最高，為30.37 U;而菌株 bdh 組合的酶活力為 26.04 U，遠遠超過別的組合菌株。可以看出菌株rh、bd、bh組合的β－葡萄糖苷酶的酶活力基本沒有太大的變化，這3組兩株菌的組合中存在著菌株之間的相互作用。而β－葡萄糖苷酶活力高的組合，在菌株混合之后相互促進β－葡萄糖苷酶的分泌。纖維素的酶水解是由外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶系統(tǒng)作用的結(jié)果［8］。

表7 混合菌組合的β－葡萄糖苷酶酶活力

混合菌組合的濾紙酶活力見表8，其中最高的兩個組合是菌株rd和菌株bdh組合，酶活力達66.89 U和72.13 U，菌株之間具有協(xié)同效應。而rbdh組合酶活力僅僅達53.68 U，可見并不是把各種菌放在一起才會是效果更好，菌株之間存在相互抑制產(chǎn)酶的作用，導致4種菌混合在一起酶活力并沒有特別高。從第6天起，各種組合的酶活力緩慢下降。

表8 混合菌組合的濾紙酶活力

3 討論

羧甲基纖維素培養(yǎng)基應用剛果紅染色法用于鑒別產(chǎn)纖維素酶的菌株，能初步判定菌株酶活力性的高低，本研究得到的4株細菌，24 h所產(chǎn)生的水解圈最大的為菌株d，但菌株d是哪種菌有待于進一步研究。

綜合以往的研究方法，認為單純通過單獨培養(yǎng)的方法獲得的纖維素分解單菌在功能發(fā)揮上受到很大限制。本研究篩選出的4株較好的纖維素降解細菌b、d、r、h單獨發(fā)酵培養(yǎng)的酶活力相對沒有混合菌的酶活力高，而通過各種菌株組合，最后得出酶活力最高的是rd組合和bdh組合;綜合總體酶活力，bdh組合的效果最佳，其具體應用有進一步研究的價值與意義。

本研究采用松針為碳源，篩選產(chǎn)纖維素酶的菌株，由于不同的碳源對菌株產(chǎn)纖維素酶具有不同的誘導能力，而目前普遍認為纖維素酶是一種具有不同底物特異性的多組分酶系。因此，對這些菌種的發(fā)酵條件進一步優(yōu)化，才會更大程度上提高混合細菌降解松針的纖維素酶活力和羧甲基纖維素酶活力。

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