葉輝，應(yīng)小明，馬江林，童夏生，趙蓓

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬黃巖醫(yī)院 兒科，浙江 臺州 318020；2.臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 兒科，浙江臺州 317523）

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，由多種炎癥細(xì)胞和炎癥組分參與，其中包括中性粒細(xì)胞（PMN）及其分泌產(chǎn)物。PMN在哮喘急性發(fā)作時被激活，分泌多種酶、炎癥遞質(zhì)和細(xì)胞因子等，共同參與哮喘的炎癥過程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）在哮喘的氣道炎癥和氣道重構(gòu)中起著重要作用[2-3]。本實驗通過制備哮喘動物模型，檢測iNOS、TGF-β1在PMN中的表達(dá)水平，探討PMN參與哮喘發(fā)病的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑 卵白蛋白（OVA）和Histopaque 1119、Histopaque 1083分離液購自美國Sigma公司，山羊抗大鼠iNOS一抗免疫組織化學(xué)試劑盒購自美國Santa Cruz公司，小鼠抗大鼠TGF-β1單克隆抗體購自英國Abcam公司，兔抗山羊二抗試劑盒購自上海晶美公司。

1.2 實驗動物及分組 SPF級健康雄性SD大鼠20只，6～8周齡，體質(zhì)量（234±19）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[動物批號：SCXK（浙）2005-0019]，在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)。隨機(jī)分成哮喘組和對照組，每組10只。

1.3 模型的復(fù)制 參照文獻(xiàn)[4]，于實驗開始第1天和第8天分別腹腔注射OVA/Al（OH）3混合液1 mL[內(nèi)含OVA 1 mg和Al（OH）3100 mg]致敏；第15天開始使用空氣壓縮霧化器（由德國百瑞公司生產(chǎn)）向置于密閉有機(jī)玻璃容器內(nèi)的大鼠噴霧1% OVA，每天吸入30 min，連續(xù)激發(fā)7 d。哮喘大鼠表現(xiàn)為煩躁不安、瘙癢、喘鳴、腹肌抽搐等癥狀。對照組致敏和激發(fā)均以0.9%氯化鈉溶液替代OVA/Al（OH）3混合液和OVA溶液。

1.4 血PMN的分離純化 大鼠末次激發(fā)24 h后，1%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉，心臟抽血4 mL，抗凝后加至備有分離液（Histopaque 1119和Histopaque 1083各4 mL）的離心管中，4 ℃，700 r/min離心（KDC-1044低速離心機(jī)由科大創(chuàng)新股份有限公司生產(chǎn)）30 min，取PMN富集層，低滲法溶解紅細(xì)胞，錐蟲藍(lán)染色查細(xì)胞活力＞86%，瑞氏染色顯示PMN純度＞89%，細(xì)胞涂片采用免疫組織化學(xué)SP法行iNOS、TGF-β1蛋白測定。每張細(xì)胞涂片隨機(jī)計數(shù)50個陽性細(xì)胞，Image-pro Plus 5.1免疫組織化學(xué)圖像分析系統(tǒng)對陽性細(xì)胞進(jìn)行灰度掃描，取其平均值代表該片的光密度（OD）值。

1.5 標(biāo)本的制備 取大鼠左肺組織，經(jīng)常規(guī)固定、石蠟包埋、切片，HE染色，400倍光鏡（日本OLYMPUS）下觀察肺組織的病理變化和炎性細(xì)胞浸潤情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理改變 大鼠肺組織切片HE染色顯示：哮喘組可見細(xì)支氣管上皮黏膜層增厚，多種炎性細(xì)胞浸潤，包括PMN、嗜酸性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，伴有較多黏液形成；對照組細(xì)支氣管形態(tài)規(guī)則、管腔內(nèi)分泌物少，偶見炎性細(xì)胞浸潤（見圖1-2）。

圖1 對照組肺組織（HE，×400）

圖2 哮喘組肺組織（HE，×400）

2.2 血PMN中iNOS、TGF-β1蛋白的表達(dá) 免疫組織化學(xué)法顯示陽性細(xì)胞的胞漿呈棕黃色表達(dá)，2組中PMN均有不同程度的表達(dá)。哮喘組PMN中iNOS和TGF-β1蛋白的表達(dá)水平顯著高于對照組P＜0.01（見表1、圖3-6）。

表1 血PMN中iNOS、TGF-β1蛋白的表達(dá)（OD值，±s）

表1 血PMN中iNOS、TGF-β1蛋白的表達(dá)（OD值，±s）

注：實驗過程中，哮喘組有1只大鼠死亡

組別 n i N O S T G F-β 1對照組 1 0 0.0 7 6±0.0 1 4 0.1 3 1±0.0 1 5哮喘組 9 0.1 2 2±0.0 1 7 0.2 2 8±0.0 1 6 t-6.4 5 6 -1 3.2 7 1 P＜0.0 1 ＜0.0 1

3 討論

哮喘被認(rèn)為是以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤為主的氣道慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病，但最近研究發(fā)現(xiàn)，PMN在哮喘發(fā)病過程中同樣具有重要作用。不管是在哮喘急性發(fā)作和致命性哮喘中，還是在輕度、中度和重度哮喘中，PMN在氣道黏膜中表達(dá)均增加，可能對氣道炎癥和氣道重構(gòu)有積極的促進(jìn)作用。我們先前研究顯示，哮喘急性發(fā)作時PMN合成基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）增加，經(jīng)布地奈德治療后，其表達(dá)水平顯著性下降，提示PMN可能部分通過MMP-9參與了哮喘的氣道炎癥過程[5]。

一氧化氮（NO）被認(rèn)為是一種重要的內(nèi)源性氣體信號分子，在機(jī)體內(nèi)起著雙重的作用。少劑量的NO起著擴(kuò)張血管和舒張支氣管平滑肌等作用，大劑量則可引起氣道炎癥、水腫、肺損傷等不良反應(yīng)[1]。iNOS是機(jī)體生成內(nèi)源性NO的主要催化酶之一，在受炎癥因子IL-1、TNF-α等刺激后會被誘導(dǎo)而產(chǎn)生，其催化效率較高，一旦其誘導(dǎo)生成，將持續(xù)產(chǎn)生NO直至底物耗盡為止[6]。哮喘急性期，大量炎性因子產(chǎn)生，誘導(dǎo)大量iNOS合成，從而產(chǎn)生過量的NO，進(jìn)一步加重氣道炎癥和組織的損傷[7]。本實驗發(fā)現(xiàn)，哮喘組血PMN中iNOS表達(dá)顯著高于對照組，表明哮喘急性發(fā)作期PMN合成iNOS蛋白的功能增加，提示PMN可能通過NO途徑參與哮喘氣道炎癥過程。

圖3 免疫組織化學(xué)法顯示對照組大鼠血PMN iNOS蛋白呈弱陽性表達(dá)（×400）

圖4 免疫組織化學(xué)法顯示哮喘組大鼠血PMN iNOS蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)（×400）

圖5 免疫組織化學(xué)法顯示對照組大鼠血PMN TGF-β1蛋白呈弱陽性表達(dá)（×400）

圖6 免疫組織化學(xué)法顯示哮喘組大鼠血PMN TGF-β1蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)（×400）

TGF-β1是一種多功能細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)以及細(xì)胞生長和分化等方面均發(fā)揮著重要作用。近年來研究[8-9]表明，TGF-β1在哮喘急性發(fā)作中起重要作用。Vignola等[10]對哮喘氣道標(biāo)本活檢發(fā)現(xiàn)氣道上皮及黏膜下TGF-β1的表達(dá)較健康人明顯增高，且表達(dá)水平與哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)，哮喘組血PMN中TGF-β1表達(dá)較對照組明顯增高，表明PMN能通過TGF-β1參與哮喘的炎癥過程。但洪建國等[11]檢測了60例輕、中度哮喘兒童血漿TGF-β1濃度及單個核細(xì)胞內(nèi)TGF-β1 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者均較對照組明顯降低，認(rèn)為哮喘兒童體內(nèi)TGF-β1分泌不足，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能紊亂，從而形成哮喘發(fā)生的環(huán)境。因此，對于TGF-β1引起哮喘氣道炎癥反應(yīng)和氣道重構(gòu)的具體機(jī)制，仍需進(jìn)行更深入的研究。

以上結(jié)果表明，哮喘大鼠血PMN中iNOS、TGF-β1的表達(dá)增高，它們可能參與了哮喘的氣道炎癥過程。因此，探索降低iNOS、TGF-β1等表達(dá)水平的方法和藥物將可能成為治療哮喘新的有效途徑之一。

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