張艷，盧文玉

（天津大學(xué)化工學(xué)院，系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072）

萜類化合物是最大的一類小分子天然化合物，目前有超過40000多種[1]，其中很多化合物都具有藥用價值，如具有抗癌作用的紫杉醇、人參皂苷RH2，具有抗瘧疾作用的青蒿素等。然而，除了甾醇及胡蘿卜素，大多數(shù)萜類化合物是通過次級代謝途徑合成的[2]。目前萜類的生產(chǎn)主要依賴于植物栽培，組織和細胞培養(yǎng)、生物轉(zhuǎn)化，盡管已經(jīng)取得了很大的進展，但是仍然面臨著產(chǎn)量低，培養(yǎng)過程難等一些問題[3]，因此萜類化合物的工業(yè)生產(chǎn)需要尋求更高效的方式。在近年來日益積累的合成生物學(xué)研究中，萜類化合物的異源合成成了研究熱點。大腸桿菌和釀酒酵母是最常用的底盤細胞。釀酒酵母細胞作為工業(yè)化的細胞工廠，曾在醫(yī)藥、食品添加劑、生物能源以及化學(xué)品的工業(yè)生產(chǎn)中表現(xiàn)出色[4]。釀酒酵母具有成熟的真核表達系統(tǒng)，更適合異源真核蛋白活性的表達；其甲羥戊酸途徑為異源萜類化合物的合成提供了直接前體，作為該途徑主要的產(chǎn)物之一，麥角甾醇的濃度可以達到釀酒酵母細胞干重的5%[5]，說明釀酒酵母具有高效合成萜類化合物的潛力。

1 釀酒酵母甲羥戊酸代謝途徑

圖1 釀酒酵母甲羥戊酸代謝途徑

釀酒酵母甲羥戊酸代謝途徑如圖1所示。法尼基焦磷酸（FPP）是合成甾醇、血紅素、長萜醇和醌類的前體物質(zhì)[6]。在牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）合成酶的催化下，F(xiàn)PP與一分子IPP聚合形成 GGPP，它是合成醌類更直接的前體化合物。順式異戊烯轉(zhuǎn)移酶（RER2）催化 IPP分子與 FPP聚合形成的聚丙烯二磷酸長鏈（12-24異戊二烯單體），在類異戊二烯磷酸酶的作用下去磷酸化，并由α-飽和酶催化合成多萜醇[7]。

FPP用于合成甾醇的量要多于非甾醇類化合物。FPP在鯊烯合成酶，鯊烯環(huán)氧酶催化下轉(zhuǎn)化為2,3-氧化鯊烯。2,3-氧化鯊烯經(jīng)過 14步酶催化作用合成麥角甾醇。甾醇是真核細胞膜重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)控成分，其中麥角甾醇決定了生物膜流動性和滲透性[8]。在酵母中，自由態(tài)的麥角甾醇存在于膜結(jié)構(gòu)中，主要在質(zhì)膜上。麥角甾醇和其他甾醇可以以脂肪酸酯的形式儲存于脂肪粒中，甾醇?；D(zhuǎn)移酶Are2p和 Are1p負責(zé)酯化[9]。該代謝途徑已相當(dāng)清晰，結(jié)構(gòu)基因都已被克隆；但是該途徑受到復(fù)雜的反饋抑制，調(diào)控機制還不是非常清晰。

1.1 釀酒酵母甲羥戊酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶

3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶（HMGR）是上游合成途徑的主要限速節(jié)點。HMGR1和HMGR2為HMGR的兩個同工酶，其中HMGR1提供了80%的活性。過表達可溶的，不再與膜結(jié)合的HMG1截短蛋白將使得鯊烯大量積累[6]。Hmg1編碼有氧環(huán)境下對數(shù)生長期需要的主要是HMGR酶活，而Hmg2編碼的 HMGR主要用于穩(wěn)定期或者無氧條件下。HMGR在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和蛋白水平都受到甲羥戊酸途徑的調(diào)控[10]。研究表明，當(dāng)鯊烯合酶的表達受到抑制時法尼醇的合成量增加，HMGR2結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為折疊松弛的狀態(tài)，加速了HMGR2的降解；當(dāng)胞內(nèi)麥角甾醇含量較高時，依賴于HMGR1的鯊烯合成途徑被強烈抑制。

鯊烯合酶（ERG9）催化 FPP向三萜類化合物轉(zhuǎn)化的第一個酶促反應(yīng)。ERG9的表達受血紅素激活蛋白轉(zhuǎn)錄因子HAP1和Hap1/2/3/4p，酵母激活蛋白轉(zhuǎn)錄因子yAP-1和磷脂轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體Ino2/4的調(diào)控。在Erg9啟動子的上游序列中，存在抑制型順式元件（URS）和誘導(dǎo)型順式元件（UAS）[11]。這表明細胞對ERG9表達的調(diào)控不僅復(fù)雜而且嚴謹。

釀酒酵母鯊烯還氧酶ERG1雙重分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂肪粒中。ERG1在兩個細胞器之間的分布是可調(diào)控的，當(dāng)ERG1超出細胞需要的范圍時，會轉(zhuǎn)移至脂肪粒中，以無活性的狀態(tài)存在；當(dāng)細胞需要時，它會再次轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，發(fā)揮其活性[12]。ERG1能夠分布在脂肪粒中依賴于其前 28個氨基酸形成的疏水結(jié)構(gòu)[13]。編碼鯊烯環(huán)氧酶的基因 Erg1的過表達會使得鯊烯大量減少，羊毛甾醇大量合成[6]，表明該酶是限制鯊烯合成麥角甾醇的節(jié)點。

催化下游反應(yīng)的酶ERG27、ERG26和ERG25構(gòu)成一個多核蛋白體——C4脫甲基化復(fù)合體一起發(fā)揮作用[14]， ERG28作為跨膜支架蛋白，負責(zé)把這些蛋白附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。同時ERG28與甾醇代謝途徑中的酶ERG6、ERG11和ERG1存在作用關(guān)系。

ERG27與羊毛甾醇合成酶ERG7存在相互作用的關(guān)系。Gachotte 等[15]在表征釀酒酵母 Erg27基因的性質(zhì)的過程中發(fā)現(xiàn)，Erg27基因的缺失導(dǎo)致鯊烯，氧化鯊烯及鯊烯二氧化物的大量積累，這種現(xiàn)象表明 ERG27對于 ERG7的活性是必要的。Mo等[16]發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母 ERG27缺失菌株中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂肪粒中的ERG7（52kDa）比野生菌株中ERG7（75kDa）小，而且喪失了羊毛甾醇合成酶的活性，這說明ERG27對于ERG7穩(wěn)定分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂肪粒中都是必要的。Layer等[17]篩選到了不依賴于ERG27，且能夠穩(wěn)定存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的ERG7突變體；并通過將ERG7與ERG28融合表達于Erg27缺失菌株中，使缺失菌株恢復(fù)了麥角甾醇合成能力，這一結(jié)果更加印證了ERG27能夠輔助ERG7結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。而ERG27怎樣使ERG7穩(wěn)定地存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上不得而知。

1.2 釀酒酵母甲羥戊酸途徑中的全局調(diào)控機制

在釀酒酵母細胞中，激活劑 UPC2和 ECM22屬于真菌轉(zhuǎn)錄因子Zn[22]-Cys[6]雙核家族。二者能結(jié)合在多數(shù)麥角甾醇合成基因的啟動子，通過激活這些基因的表達實現(xiàn)對甾醇生物合成的調(diào)控。UPC2和ECM22能直接結(jié)合在Erg2啟動子上，其中7 bp的堿基序列是關(guān)鍵的結(jié)合位點。在釀酒酵母其他受甾醇調(diào)控的基因啟動子中也具有相同的7 bp序列元件，這表明這些基因的表達也可能是受 UPC2和ECM22 調(diào)控的[18-19]。

UPC2的突變體UPC2-1具有更強的誘導(dǎo)效力，該突變體是通過替換 Upc2p C-末端一個氨基酸得到的。ECM22相同位點的突變同樣大大提高了轉(zhuǎn)錄激活的效果。但是UPC2和ECM22對于麥角甾醇調(diào)控的反應(yīng)大不相同，當(dāng)麥角甾醇含量不足時，UPC2的含量會增高，而ECM22含量降低[20]。

MOT3是釀酒酵母細胞中的一種細胞核蛋白，富含帶電氨基酸，有兩個鋅指結(jié)構(gòu)[21]。轉(zhuǎn)錄分析表明 MOT3能抑制甾醇合成途徑中基因 Erg2，Erg6和 Erg9的轉(zhuǎn)錄。MOT3的抑制機制可能是通過與ECM22直接結(jié)合抑制 ECM22誘導(dǎo)的進行而介導(dǎo)的。

2 釀酒酵母甲羥戊酸途徑在萜類化合物合成中的應(yīng)用

釀酒酵母甲羥戊酸途徑中的中間代謝物牻?；沽姿帷⒎峄沽姿?、牻牛兒基牻牛兒焦磷酸和2,3-氧化鯊烯分別是單萜、倍半烯萜、二萜和三萜類化合物的直接前體。對此代謝途徑的了解為異源萜類化合物在釀酒酵母的合成提供了理論基礎(chǔ)。釀酒酵母細胞作為底盤合成異源萜類化合物的研究取得了卓有成效的成果，具體的成功案例將在下文一一列舉。

2.1 單萜

單萜類化合物的直接前體牻牛兒基焦磷酸（GPP）是由牻牛基焦磷酸合成酶（GPS）催化得到的。釀酒酵母Erg20基因編碼的法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）兼具GPS和FPPS的活性。在酶反應(yīng)的過程中，中間物GPP不離開酶的活性中心，而直接與IPP反應(yīng)被催化為FPP。由于兩個酶活性很難分開，GPP在細胞中沒有積累，因此釀酒酵母作為底盤細胞高效表達異源單萜類化合物的可能極小。

Fischer等[22]對釀酒酵母 ERG20催化位點K197做了一系列的定點突變。突變菌株表現(xiàn)出來不同的生長速率，甾醇合成量，和單萜合成能力。較優(yōu)突變菌株（K197G， A， S，T）獲得了高達5 mg/L的 GPP，相對于未修飾 ERG20有了巨大的提高。為單萜化合物的合成提供了平臺。

2.2 倍半烯萜

青蒿素是從治療瘧疾的中草藥黃花蒿中分離出來的有效單體，被世界衛(wèi)生組織評價為治療惡性瘧疾唯一真正有效的藥物，并沿用至今。因其極少引起交叉抗性，成為抗瘧疾的首選藥物。青蒿二烯和青蒿酸是青蒿素代謝途徑中的兩個中間化合物。

Keasling研究組[23-24]以釀酒酵母S288C為底盤細胞構(gòu)建表達青蒿素前體物青蒿二烯的釀酒酵母工程菌株，通過高表達青蒿二烯合成酶（ADS）基因，過表達Erg20和tHmgr，以及Upc2轉(zhuǎn)錄因子的突變體基因Upc2-1；用Met3啟動子弱化鯊烯合成酶的表達來普遍提高甲羥戊酸途徑的表達；在此基礎(chǔ)上表達青蒿二烯氧化酶（AMO），負責(zé)青蒿二烯三步氧化的細胞色素 P450和青蒿細胞色素還原酶（AaCPR）功能模塊，青蒿酸產(chǎn)量達100 mg/L。

東印度檀香油已廣泛用于化妝品和香料領(lǐng)域，近來發(fā)現(xiàn)其具有抗皮膚癌的潛質(zhì)。α-檀香醇是東印度檀香油的主要成分之一。α-檀香萜合成酶能夠在酵母中表達，并催化FPP合成α-檀香醇的前體物α-檀香萜。

在構(gòu)建異源表達α-檀香萜的釀酒酵母工程菌過程中，Scalcinati等[25]用Hxt1啟動子替換釀酒酵母Erg9啟動子。高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的Hxt1啟動子調(diào)控 Erg9的表達時，碳通量從甾醇合成流向 α-檀香萜的合成，使α-檀香萜的合成效率提高3.4倍；同時過表達tHmgr，并缺失脂磷酸磷酸酶的基因Lpp1，α-檀香萜的合成水平達 0.18mg/g(CDW)-1(h)-1；缺失另一種以法尼基焦磷酸為底物的焦磷酸鹽磷酸酶，α-檀香萜的產(chǎn)量提高到了92mg/L。

2.3 二萜

紫杉醇及其衍生物具有抗惡性腫瘤、防治移植硬化動脈、抗瘢痕形成和抗血管生成等作用，目前主要被用于治療惡性腫瘤。分析發(fā)現(xiàn)，紫杉二烯是紫杉醇合成途徑中的重要中間體，也是一類二萜化合物，由GGPP經(jīng)紫杉二烯合成酶（TS）催化環(huán)化得到的。

DeJong等[26]實現(xiàn)了紫杉二烯在釀酒酵母YPH499中的合成，產(chǎn)量為 1.0mg/L。2008年，Engels等[27]通過過表達tHmgr1、Upc2-1，并用嗜酸熱硫化葉菌牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（GGPPS）替換紅豆杉GGPPS，并依照釀酒酵母的密碼子偏好性對紫杉二烯合成酶基因進行密碼子優(yōu)化，紫杉二烯的產(chǎn)量提高到了 8.7mg/L。同時釀酒酵母細胞中GGPP的含量為33.1mg/L，這表明紫杉二烯的產(chǎn)量還有提高的空間。閆慧芳等[28]以組成型表達的形式引入外源紫杉二烯合成模塊，并通過過表達tHmgr和Erg20，獲得了紫杉二烯合成水平達11.5mg/L的釀酒酵母菌株；優(yōu)化發(fā)酵條件后，紫杉二烯的合成量提高到了19.5mg/L。

丹參酮類化合物屬于二萜醌類化合物，為中藥材丹參的主要活性成分，主要用于心血管疾病的治療。丹參中，甲羥戊酸途徑形成二萜前體物質(zhì)GGPP，GGPP經(jīng)SmCPS和SmKSL兩個酶依次作用合成次丹參酮二烯，經(jīng)一系列的生物后修飾過程合成丹參酮。

周雍進等[29]通過在釀酒酵母中融合表達SmCPS和 SmKSL、釀酒酵母內(nèi)源的 GGPP合酶（BST1）和法尼基焦磷酸合酶（FPPS），次丹參酮二烯的發(fā)酵產(chǎn)量達到365mg/L；說明調(diào)節(jié)多酶多步反應(yīng)體系中酶活性中心的空間距離對提高底物傳遞效率非常有效。戴住波等[30]用抗性標(biāo)記的質(zhì)粒過表達SmCPS和SmKSL基因，釀酒酵母細胞能夠產(chǎn)生4.2mg/L 的次丹參酮二烯；在此基礎(chǔ)上過表達內(nèi)源tHmgr 基因和突變的全局調(diào)控因子Upc2-1基因，將FPPS與GGPP合酶融合表達（基因Erg20-Bts1），并輔以嗜酸熱硫化葉菌GGPP合酶的過表達，由于協(xié)同作用次丹參酮二烯產(chǎn)量提高到了61.8mg/L。通過對分批發(fā)酵過程進行優(yōu)化，次丹參酮二烯的產(chǎn)量高達488mg/L。

2.4 三萜

人參被列為名貴中藥材，在保護心血管、增強免疫力、保肝、抗癌、抗衰老等方面得到廣泛應(yīng)用；人參皂苷是其生物活性成分。不同的環(huán)化步驟形成不同的人參皂苷單體[31]。β-香樹脂醇合成酶（β-AS）使2,3-氧化鯊烯環(huán)化為β-香樹脂醇，最后合成齊墩果烷型皂苷；達瑪烯二醇合成酶（DS）催化2,3-氧化鯊烯形成原人參二醇，是達瑪烷型皂苷的前體。細胞色素P450和糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）負責(zé)下游生物化學(xué)修飾形成不同的人參皂苷單體。

Kirby等[32]從 A.annua中分離出β-香樹脂醇合成酶，并將其引入釀酒酵母中；通過過表達釀酒酵母內(nèi)源基因tHmg1，同時弱化Erg7的表達，使得β-香樹脂醇產(chǎn)量達6mg/L。分析發(fā)現(xiàn)該工程菌中鯊烯水平提高了12倍，然而過表達Erg1并沒有解決問題，這表明 ERG1限速并不在轉(zhuǎn)錄水平。Madsen等[33]通過比對釀酒酵母CEN.PK 1137D和S288C菌株的基因型，發(fā)現(xiàn)與麥角甾醇和脂肪酸合成相關(guān)的基因Erg8，Erg9，Hfa1含有單核苷酸多態(tài)性，比較分析發(fā)現(xiàn)來自CEN.PK 1137D的3個酶的穩(wěn)定性較S288C菌株高。在引入植物源β-香樹脂醇合成酶的CEN.PK 1137D菌株中同時過表達3個內(nèi)源基因，工程菌株合成β-香樹脂醇的能力提高了500%。

梁彥龍等[34]構(gòu)建的達瑪烯二醇人工釀酒酵母細胞在有氧發(fā)酵下合成量達 250μg/L，輔以無氧間歇，達瑪烯二醇的產(chǎn)量提高兩倍。他們通過對細胞微粒體、脂肪粒和細胞勻漿中達瑪烯二醇合成酶進行檢測和分析，發(fā)現(xiàn)達瑪烯二醇合成酶主要存在于脂肪粒中。張學(xué)禮等[35]用同源重組的方法構(gòu)建合成達瑪烯二醇和原人參二醇的釀酒酵母工程菌株，發(fā)酵得到達瑪烯二醇和原人參二醇的含量分別為0.261mg/L、0.257mg/L；同時提高菌株中 Erg1、Erg20、Erg9的表達量，達瑪烯二醇和原人參二醇的發(fā)酵產(chǎn)量分別高達126.379mg/L和86.906mg/L。

3 異源萜類化合物在釀酒酵母細胞中高效合成的其他方法

3.1 生物模塊與釀酒酵母底盤細胞的適配

Ohto等[36]在研究釀酒酵母生產(chǎn)異戊二烯醇（法尼醇、橙花叔醇和香葉基香葉醇）的過程中發(fā)現(xiàn)，不同菌株的釀酒酵母細胞生產(chǎn)異戊二烯醇的能力不同。同時過表達釀酒酵母 ATCC200589，ATCC208352，ATCC201238，ATCC76625，ATCC76626菌株中的Hmr1基因，結(jié)果顯示5種工程酵母細胞胞內(nèi)異戊二烯醇和鯊烯含量差別很大，而生產(chǎn)異戊二烯醇的最適底盤細胞是釀酒酵母ATCC200589菌株。

Keasling課題組發(fā)現(xiàn)CEN.PK2菌株因具有更清楚的生理特點，更適宜發(fā)酵生產(chǎn)。以 CEN.PK2為底盤細胞構(gòu)建GAL1啟動子調(diào)控的青蒿二烯途徑，并敲除需要利用半乳糖的基因Gal1，使半乳糖僅作為誘導(dǎo)物而非碳源。對產(chǎn)青蒿二烯的 CEN.PK2工程菌株進行發(fā)酵過程優(yōu)化使產(chǎn)量提高到40g/L[37]。

3.2 模塊構(gòu)建方式和組裝方式的改進

構(gòu)建一株高效表達異源萜類化合物的釀酒酵母人工細胞，往往需要對異源萜類化合物合成酶和釀酒酵母內(nèi)源途徑的多個位點進行多重改造；因此會牽涉到大量元件、模塊的構(gòu)建和組裝。高效的模塊構(gòu)建和組裝方式不僅節(jié)省時間，而且有利于工程細胞的穩(wěn)定和目的化合物的高水平表達。

Ignea等[38]采用一種可重復(fù)利用的整合盒可將目的片段插入基因組中任一位點。該整合盒包括目的片段和標(biāo)記基因，整合盒左右兩端有50 bp的同源臂序列，而且標(biāo)記基因可通過 cre-lox重組被剪掉。研究組采用這一整合方式將Hmg2，Erg20和Idi1基因過表達，實現(xiàn)了釀酒酵母異源合成植物單萜和倍半烯萜近7倍的提高；而且工程菌株具有較強的魯棒性，異源萜類的合成水平在長時間內(nèi)維持穩(wěn)定。

周雍進等[29]對重疊 PCR的程序和重疊片段之間的摩爾比例進行了調(diào)節(jié)實現(xiàn)了一步 PCR成功連接多達4個片段，獲得長達6.5kb的基因序列。相鄰的模塊之間具有重疊片段，兩端的模塊應(yīng)有與重組載體或基因組位點重疊的同源臂，把所有的模塊或載體片段電轉(zhuǎn)化進入釀酒酵母細胞，基于相互之間的同源臂，實現(xiàn)多片段的重組，進而得到多個模塊一步整合在一個載體上或者插入基因組中一個位點。張正偉等[39]利用該酵母組裝方法，對紫杉二烯生物合成模塊進行優(yōu)化的設(shè)計組裝，模塊總長度約10kb，利用單拷貝的 CEN質(zhì)粒將模塊導(dǎo)入釀酒酵母，并將模塊與不同的釀酒酵母底盤細胞進行適配研究，最終獲得紫杉二烯產(chǎn)量達74.84mg/L 的工程菌株。

4 結(jié) 語

以上研究表明萜類化合物在釀酒酵母細胞中的異源表達是高效的經(jīng)濟的生產(chǎn)萜類化合物的途徑。近年來，合成生物學(xué)在能源、醫(yī)藥、化學(xué)品等領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，為萜類化合物異源高水平合成提供了應(yīng)用基礎(chǔ)，萜類化合物的工業(yè)化生產(chǎn)將指日可待。然而，要實現(xiàn)這一目標(biāo)仍然還有很多工作需要完善。

釀酒酵母甲羥戊酸途徑為細胞提供必要的初級代謝產(chǎn)物，該途徑受到復(fù)雜而嚴謹?shù)拇x調(diào)控，目前對于相應(yīng)的調(diào)控機制尚未完全清楚，因此對該途徑的改造存在相當(dāng)大的難度，尤其是在三萜類、甾體藥物代謝途徑的構(gòu)建中。對釀酒酵母甲羥戊酸途徑的清楚認識將有助于該途徑在合成生物學(xué)中的應(yīng)用。

此外，很多萜類化合物的天然代謝途徑并不清晰，因此異源合成也只能停留在中間前體階段。如人參皂苷代謝途徑中負責(zé)糖基化的酶 GT，在植物體內(nèi)以超基因家族的形式存在，具有高度的專一性，且蛋白質(zhì)具有相似的結(jié)構(gòu)域。目前只在極少數(shù)幾種植物中克隆到了糖基轉(zhuǎn)移酶，進行酶活鑒定的屈指可數(shù)。因此，萜類化合物合成途徑的明確解析是萜類化合物實現(xiàn)異源合成的基礎(chǔ)。

另外，異源代謝途徑的植入往往對底盤細胞會產(chǎn)生壓力，異源化合物的合成也會受到排斥。研究過程中發(fā)現(xiàn)，合成青蒿酸的酵母菌株質(zhì)粒穩(wěn)定性差；實驗結(jié)果顯示，該細胞中多重抗藥基因被大量誘導(dǎo)，進一步的全局轉(zhuǎn)錄分析表明這一結(jié)果是細胞具有壓力的反映[40]。因此，異源代謝途徑與底盤細胞的微妙適配將是提高異源化合物合成水平的重要一環(huán)。

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