成振　嚴(yán)鵬　白麗娟等

[摘要] 目的 通過對(duì)Chelex-100提取法提取的DNA用于酶切的研究，為差異甲基化在法醫(yī)實(shí)際工作中的應(yīng)用性研究提供一種快速提取酶切底物的方法。 方法 HhaⅠ酶切基因組DNA，PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，254 nm紫外燈下觀察。 結(jié)果 Chelex-100提取法提取的雜合子樣本DNA加酶組只觀察到來自父源的等位基因片段，而未加酶組能夠觀察到來自父源和母源的等位基因片段。 結(jié)論 Chelex-100提取法提取的DNA能夠作為酶切底物應(yīng)用于差異甲基化基因座的研究。

[關(guān)鍵詞] 差異甲基化；聚合酶鏈反應(yīng)；Chelex-100

[中圖分類號(hào)] R446.64 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）04（a）-0107-03

[Abstract] Objective To provide a method of rapid extraction of enzyme substrate for differential methylation applied research in forensic practice by the study of the Chelex-100 extraction to extract DNA. Methods Genomic DNA was digested by HhaⅠ，with PCR amplification，detected with 2% agarose gel electrophoresis and observed under ultraviolet lamp，whose wavelength was 254 nm. Results The DNA samples with enzyme extracted by Chelex-100 from heterozygous observed was only the paternal allele fragments，while the paternal and maternal allele fragments were observed in the control group. Conclusion The DNA extracted with Chelex-100 extraction can be used as enzyme substrate，which is applied to study the differential methylation gene loci.

[Key words] Differential methylation；polymerase chain reaction；Chelex-100

越來越多的研究資料表明，來自雙親的同源染色體或者等位基因有功能上的差異：有些只有父源的基因有轉(zhuǎn)錄活性，而母源的等位基因則一直處于沉默狀態(tài)，另一些基因的情況則相反。這是由于來源于某一親本的等位基因或其所在的染色體發(fā)生了表觀遺傳修飾，導(dǎo)致不同親本來源的兩個(gè)等位基因在子代細(xì)胞中表達(dá)不同。這種親緣依賴的差異表達(dá)現(xiàn)象被稱為基因組印記，受印記機(jī)制調(diào)控而差異表達(dá)的基因稱之為印記基因[1]，許多與印記基因和印記控制中心鄰近的序列存在DNA甲基化修飾及差異甲基化序列[2]，目前對(duì)于甲基化的研究多采用甲基化敏感性酶限制性內(nèi)切酶-PCR法[3]。它是利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶對(duì)甲基化區(qū)不切割而對(duì)未甲基化區(qū)切割的特性，將DNA消化為大小不同的片段后再進(jìn)行分析的一種研究甲基化的方法[4-5]。目前用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶酶切的DNA大多是用有機(jī)溶劑法（酚/氯仿）提取或純化的DNA，而未見Chelex-100法提取DNA作為酶切底物應(yīng)用于差異甲基化基因座檢測(cè)的報(bào)道。本研究對(duì)Chelex-100法提取的DNA應(yīng)用于差異甲基化的檢測(cè)進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 樣品及試劑

100份無關(guān)人血由山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)鑒定中心提供；HhaⅠ購(gòu)自NEB公司；試驗(yàn)中引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易公司合成，OPC純度。Taq酶和Ex Taq Hot Start Version購(gòu)自寶生物工程有限公司。

1.2 基因組DNA的提取

1.3 定量模板量

經(jīng)典酚/氯仿法提取DNA的定量：紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260并定量；Chelex-100法提取DNA的定量：qPCR絕對(duì)定量。

1.4 篩選雜合子

1.5 對(duì)雜合子樣本基因組DNA用甲基化敏感酶Hha Ⅰ消化

1.6 對(duì)甲基化敏感酶HhaⅠ處理過的雜合子基因組DNA用AB引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

1.7 以AB引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板用CD引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

2 結(jié)果

6泳道只擴(kuò)增出父源一方的等位基因，表明此位點(diǎn)確為差異甲基化位點(diǎn)。1、3泳道也只擴(kuò)增出父源一方等位基因，表明HhaⅠ在Chelex-100法提取的DNA中也能夠工作，Chelex-100法提取的DNA能夠作為酶切底物用于差異甲基化基因座的檢測(cè)（圖1）。

3 討論

Chelex-100法提取的DNA能夠作為酶切底物應(yīng)用于差異甲基化基因座的檢測(cè)，筆者認(rèn)為有以下兩方面的原因：①法醫(yī)實(shí)際工作中用Chelex-100提取法提取的DNA一般用于進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系中DNA聚合酶一般除具有耐高溫的特性外，其他性質(zhì)與一般的生物酶相類似。②影響限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)效率的因素包括DNA純度、反應(yīng)緩沖液、溫度、pH值等。其中提取的DNA中包含有蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、金屬離子等雜質(zhì)，會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性，從而影響酶切反應(yīng)的效率，而Chelex-100提取法提取的DNA中一般不會(huì)存在酚、氯仿、乙醇、SDS等物質(zhì)，且Chelex-100會(huì)螯合Al、Ca、Zn、Mg、Cu、Fe、Ag、Be等常見的影響酶活性的金屬離子，在56℃水浴過程中加入PK，能夠使蛋白充分消化，減少蛋白對(duì)酶切反應(yīng)的影響。100℃煮沸使蛋白變性，Chelex-100滅活，通過離心去除Chelex-100 顆粒，使這些和Chelex-100結(jié)合的物質(zhì)與DNA分離，以免影響下一步的酶切反應(yīng)。

隨著法醫(yī)實(shí)踐中應(yīng)用甲基化敏感性酶限制性內(nèi)切酶-PCR法對(duì)差異甲基化聯(lián)合STR位點(diǎn)[6]，差異甲基化聯(lián)合SNP位點(diǎn)的研究越來越多[7]。酚/氯仿法提取的DNA雖然具有較高的純度，但是操作復(fù)雜、步驟繁多、耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，而且提取的DNA可能含有酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑，這些物質(zhì)都會(huì)對(duì)限制性內(nèi)切酶的活性具有一定的影響[8]。相比而言，Chelex-100提取法具有操作簡(jiǎn)單、檢材耗費(fèi)少、省時(shí)省力的特點(diǎn)[9]，并且該方法中用到的試劑基本無毒。在法醫(yī)工作實(shí)踐中酚/氯仿法提取的DNA檢材需求量大，而Chelex-100法用于微量檢材DNA的提取在實(shí)踐中已得到廣泛的應(yīng)用[10]，本研究也為差異甲基化能夠應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)踐提供了依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Crawford MH，Beaty KG.DNA fingerprinting in anthropological genetics：past，present，future[J].Investig Genet，2013， 4（1）：23.

[2] Anupam Paliwal，Thomas Vaissière，Zdenko Herceg.Quantitative detection of DNA methylation states in minute amounts of DNA from body fluids[J].Methods，2010，52（3）：242-247.

[3] Zhao G，Huang D，Yang R，et al.Study on the application of parent-of-origin specific DNA methylation markers to forensic genetics[J].Forensic Sci Int，2003，154（2-3）：122-127.

[4] 趙書民，李成濤.DNA甲基化在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景及其檢測(cè)方法新進(jìn)展[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（4）：290-295.

[5] Naito E，Dewa K，F(xiàn)ukuda M，et al.Novel paternity testing by distinguishing parental alleles at a VNTR locus in the differentially methylated region upstream of the human H19 Gene[J].J Forensic Sci，2003，48（6）：1275-1279.

[6] 焦祖義.D15S128位點(diǎn)的STR多態(tài)性與差異甲基化聯(lián)合進(jìn)行親子鑒定的研究[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2007.

[7] 趙貴森，艾紅偉，陳暉.SNP rs220028和 STR HUMARA位點(diǎn)甲基化標(biāo)記的時(shí)空穩(wěn)定性研究[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2006，3（6）：419-422.

[8] Singer- Sam J，Tangua RL，Riggs AD.Use of chelex to improve the PCR signal from a small number of cells[J].Amplification，1989，3（1）：11-16.

[9] 周月琴，朱偉，劉志萍，等.用Chelex-100快速提取微量血痕中的DNA[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版，2003，30（4）：379-380.

[10] 鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京：中國(guó)人民公安大學(xué)出版社，2002：38-39.

（收稿日期：2014-01-17 本文編輯：袁 成）

隨著法醫(yī)實(shí)踐中應(yīng)用甲基化敏感性酶限制性內(nèi)切酶-PCR法對(duì)差異甲基化聯(lián)合STR位點(diǎn)[6]，差異甲基化聯(lián)合SNP位點(diǎn)的研究越來越多[7]。酚/氯仿法提取的DNA雖然具有較高的純度，但是操作復(fù)雜、步驟繁多、耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，而且提取的DNA可能含有酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑，這些物質(zhì)都會(huì)對(duì)限制性內(nèi)切酶的活性具有一定的影響[8]。相比而言，Chelex-100提取法具有操作簡(jiǎn)單、檢材耗費(fèi)少、省時(shí)省力的特點(diǎn)[9]，并且該方法中用到的試劑基本無毒。在法醫(yī)工作實(shí)踐中酚/氯仿法提取的DNA檢材需求量大，而Chelex-100法用于微量檢材DNA的提取在實(shí)踐中已得到廣泛的應(yīng)用[10]，本研究也為差異甲基化能夠應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)踐提供了依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

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[5] Naito E，Dewa K，F(xiàn)ukuda M，et al.Novel paternity testing by distinguishing parental alleles at a VNTR locus in the differentially methylated region upstream of the human H19 Gene[J].J Forensic Sci，2003，48（6）：1275-1279.

[6] 焦祖義.D15S128位點(diǎn)的STR多態(tài)性與差異甲基化聯(lián)合進(jìn)行親子鑒定的研究[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2007.

[7] 趙貴森，艾紅偉，陳暉.SNP rs220028和 STR HUMARA位點(diǎn)甲基化標(biāo)記的時(shí)空穩(wěn)定性研究[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2006，3（6）：419-422.

[8] Singer- Sam J，Tangua RL，Riggs AD.Use of chelex to improve the PCR signal from a small number of cells[J].Amplification，1989，3（1）：11-16.

[9] 周月琴，朱偉，劉志萍，等.用Chelex-100快速提取微量血痕中的DNA[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版，2003，30（4）：379-380.

[10] 鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京：中國(guó)人民公安大學(xué)出版社，2002：38-39.

（收稿日期：2014-01-17 本文編輯：袁 成）

隨著法醫(yī)實(shí)踐中應(yīng)用甲基化敏感性酶限制性內(nèi)切酶-PCR法對(duì)差異甲基化聯(lián)合STR位點(diǎn)[6]，差異甲基化聯(lián)合SNP位點(diǎn)的研究越來越多[7]。酚/氯仿法提取的DNA雖然具有較高的純度，但是操作復(fù)雜、步驟繁多、耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，而且提取的DNA可能含有酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑，這些物質(zhì)都會(huì)對(duì)限制性內(nèi)切酶的活性具有一定的影響[8]。相比而言，Chelex-100提取法具有操作簡(jiǎn)單、檢材耗費(fèi)少、省時(shí)省力的特點(diǎn)[9]，并且該方法中用到的試劑基本無毒。在法醫(yī)工作實(shí)踐中酚/氯仿法提取的DNA檢材需求量大，而Chelex-100法用于微量檢材DNA的提取在實(shí)踐中已得到廣泛的應(yīng)用[10]，本研究也為差異甲基化能夠應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)踐提供了依據(jù)。

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[5] Naito E，Dewa K，F(xiàn)ukuda M，et al.Novel paternity testing by distinguishing parental alleles at a VNTR locus in the differentially methylated region upstream of the human H19 Gene[J].J Forensic Sci，2003，48（6）：1275-1279.

[6] 焦祖義.D15S128位點(diǎn)的STR多態(tài)性與差異甲基化聯(lián)合進(jìn)行親子鑒定的研究[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2007.

[7] 趙貴森，艾紅偉，陳暉.SNP rs220028和 STR HUMARA位點(diǎn)甲基化標(biāo)記的時(shí)空穩(wěn)定性研究[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2006，3（6）：419-422.

[8] Singer- Sam J，Tangua RL，Riggs AD.Use of chelex to improve the PCR signal from a small number of cells[J].Amplification，1989，3（1）：11-16.

[9] 周月琴，朱偉，劉志萍，等.用Chelex-100快速提取微量血痕中的DNA[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版，2003，30（4）：379-380.

[10] 鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京：中國(guó)人民公安大學(xué)出版社，2002：38-39.

（收稿日期：2014-01-17 本文編輯：袁 成）