王凇，翁勰，龔偉，李榮杰，王延杰，梅興國，楊薇

·實驗研究Experimental research·

熱敏脂質(zhì)體抗腫瘤藥物改善肝腫瘤熱消融療效的動物實驗

王凇，翁勰，龔偉，李榮杰，王延杰，梅興國，楊薇

目的探討射頻消融（RFA）聯(lián)合抗腫瘤藥物熱敏脂質(zhì)體長春瑞濱（TL-VIN）治療腫瘤的病理機制，分析聯(lián)合治療對改善實驗動物長期生存率的影響。方法采用皮下種植H 22肝腺癌模型的國產(chǎn)雄性ICR荷瘤小鼠入組本研究。分3階段分別進行腫瘤壞死面積測量，分析治療后腫瘤病理表現(xiàn)；測量瘤內(nèi)藥物濃度；以及對不同組治療后生存率的比較。第1階段，選取40只荷瘤小鼠隨機接受5組不同治療方案（每組8只）治療后24 h取腫瘤切片，分別測量壞死面積，確認(rèn)最佳熱敏脂質(zhì)體藥物濃度；以及分析各組腫瘤治療后的病理表現(xiàn)。第2階段，選取13只荷瘤小鼠治療后0.5 h取出腫瘤組織，測量瘤內(nèi)藥物濃度。第3階段，選取32只荷瘤小鼠隨機進入4組（每組8只），治療后隨訪90 d繪制腫瘤生長曲線，比較各組小鼠腫瘤治療后的生存率。結(jié)果與單純RFA組相比，TL-VIN顯著增加RFA對肝腫瘤的破壞范圍（P＜0.01），而游離長春瑞濱（free-VIN）聯(lián)合RFA的腫瘤壞死面積與單純RFA相似（P＞0.05）。TLVIN藥物濃度在10mg/kg時可獲得顯著優(yōu)于free-VIN的效果，為（341.8±65.4）mm2比（225.3±25.4）mm2（P＜0.01）。單純RFA組消融區(qū)邊緣壞死及變性細(xì)胞與正常肝組織交叉，界限不清；而聯(lián)合治療組消融區(qū)邊緣變性細(xì)胞減少，與正常組織分界更清晰。RFA聯(lián)合治療中，TL-VIN在腫瘤內(nèi)沉積效果顯著增加，濃度約為free-VIN的10倍，為（1 156.5±158.3）ng/m l比（194.5±52.3）ng/m l（P=0.005）。TL-VIN+RFA平均終點生存期最長，達（37.6±20.1）d，優(yōu)于free-VIN+RFA（23.3±1.2）d及單獨RFA組（23.4±5.0）d，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論應(yīng)用新型藥物載體——熱敏脂質(zhì)體長春瑞濱可以在加熱狀態(tài)下大量釋放藥物，提高瘤內(nèi)濃度，增強與熱消融協(xié)同作用，擴大壞死范圍，并最終改善生存期，為RFA治療提供了有效的輔助手段。

射頻消融；肝腫瘤；熱敏脂質(zhì)體；抗腫瘤藥物；聯(lián)合治療

如何克服射頻消融（RFA）治療腫瘤的局限性成為目前研究的熱點問題。RFA聯(lián)合脂質(zhì)體納米技術(shù)遞送化療藥物的治療模式引起了極大的關(guān)注［1］。與傳統(tǒng)脂質(zhì)體藥物相比，熱敏感脂質(zhì)體在熱消融中輔助給藥時，使藥物在加熱的腫瘤脈管中立即釋放，提高局部藥物濃度［2］。本研究應(yīng)用熱敏脂質(zhì)體長春瑞濱（thermosensitive liposomal vinorelbine，TL-VIN）與RFA聯(lián)合治療荷瘤小鼠，以期評價RFA聯(lián)合TL-VIN/free-VIN的各種治療方案對腫瘤壞死面積的影響及病理基礎(chǔ)；定量檢測RFA與熱敏脂質(zhì)體藥物聯(lián)合應(yīng)用對瘤內(nèi)藥物濃度改變；聯(lián)合治療對小鼠長期生存率的改善。本研究獲北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

健康、雄性的國產(chǎn)ICR小鼠85只，體重（28± 2）g，購自維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

消融儀器為CC-1-220型單極RFA儀（Valleylab公司，泰科醫(yī)療，美國），發(fā)生器頻率480 kHz，最大輸出功率40W，21 G Cool-tip射頻電極針，長度15 cm，尖端裸露0.7 cm。

重酒石酸長春瑞濱制劑（雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司），二棕櫚酰膽堿（DPPC）、monopalmitoylphosphatidylcholine（MPPC）和1，2-distearyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-［methoxy（polyethyl-eneglycol）-2000］（DSPE-mPEG2000）均購于美國Lipids公司，Agilent 6410三重四極質(zhì)譜（ESI），Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)（安捷倫科技，圣克拉拉，加利福尼亞，美國）和Agela C18反相色譜柱（Agela Venusil XBPC18，2.1×50 mm，3μm，博納艾杰爾科技公司，波士頓）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作及動物分組

1.2.1.1 動物模型制作:將凍存的H22腹水瘤細(xì)胞取出，37℃條件下復(fù)蘇后予ICR小鼠腋窩皮下注射0.3～0.4m l，7 d后長成直徑約0.9 cm的瘤塊。切取瘤塊周邊生長旺盛的魚肉樣組織，用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊植瘤于150只小鼠腹部皮下。腫塊種植后21～28 d均長成直徑為1.0～1.2 cm的腫瘤。

1.2.1.2 動物分組:第1段取40只（共40個腫瘤）隨機接受5組不同治療方案（每組均8只），即:①單純RFA組；②酒石酸長春瑞濱聯(lián)合RFA組（free-VIN+RFA）；③，④，⑤組:TL-VIN+RFA治療組，又以TL-VIN藥物濃度分別為5、10和20 mg/kg。第2階段取13只，10只為雙瘤（共計20個腫瘤）的荷瘤小鼠，平均分為TL-VIN、TL-VIN聯(lián)合RFA組與free-VIN、free-VIN聯(lián)合RFA組（每組5個腫瘤）；余下3只為單瘤（共計3個腫瘤）荷瘤小鼠未接受任何治療，作為陰性對照組。第3階段取32只（共32個腫瘤）隨機分為4個治療組（每組均8只）:①單獨RFA組；②free-VIN聯(lián)合RFA組；③TL-Vin聯(lián)合RFA組；④荷瘤對照組。

1.2.2 熱敏脂質(zhì)體長春瑞濱的制備和應(yīng)用參考相關(guān)文獻制備TL-VIN［3］。

在動物實驗中，將制備好的TL-VIN或free-VIN經(jīng)尾靜脈緩慢注射，濃度為均1mg/ml，劑量為0.125，0.25和0.5 ml。

1.2.3 RFA治療方法荷瘤小鼠按45 mg/kg腹腔注射5%戊巴比妥鈉，麻醉后腹部及背部脫毛，使用21 G射頻電極針，電極針尖垂直插入腫瘤中心，確保針尖溫度保持（70±2）℃，消融時間5 min。經(jīng)尾靜脈注射藥物治療的小鼠在注射30 min后進行RFA治療。

1.2.4 取材方法第1階段所有小鼠在治療后24 h處死，分離取出腫瘤，層厚5 mm切片，4%甲醛固定，進一步行病理染色分析。第2階段所有小鼠在治療后0.5 h處死，同法取材后。-80℃冰箱保藏，行藥物濃度分析。

1.2.5 瘤內(nèi)長春瑞濱的濃度測定使用Agilent 6410三重四極質(zhì)譜（ESI）和Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)對樣品進行LC-MS/MS分析。使用反相C18色譜柱（AgelaVenusil XBP C18，2.1×50 mm，3μm，博納艾杰爾科技公司，波士頓）對長春瑞濱和長春新堿（內(nèi)標(biāo)）進行分離，流動相為甲醇、含有醋酸銨的1%乙腈（80∶20，V/V）；流速0.3 m l/min；進樣量5μl。

1.2.6 腫瘤壞死面積測量及病理分析選擇包含腫瘤最大壞死范圍的切片行TTC染色。將標(biāo)本溫育在37℃環(huán)境下TTC（2%）溶液中15～20 min，直到觀察腫瘤標(biāo)本未壞死區(qū)域呈紅色。TTC斷面最大的未染色區(qū)（白色）為壞死面積，可以用卡尺測量2個獨立垂直尺寸而得到，壞死面積計算公式:面積=［（長徑+寬徑）/2］2×3.14。進行病理組織分析的腫瘤標(biāo)本用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，進行病理HE染色。顯微鏡下觀察不同治療后腫瘤組織的病理結(jié)構(gòu)改變。

1.2.7 生存期分析荷瘤小鼠腫瘤生長至1～1.2 cm，超聲檢查無明顯壞死的腫瘤進行治療，治療后每2～3 d游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，并描繪腫瘤生長曲線。以腫瘤最大徑達30 mm或生存達到90 d為終點，次要指標(biāo)為腫瘤生長的局部控制（即腹壁上無可見的腫瘤）。應(yīng)用Kaplan-Meier法計算動物終點生存率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

計量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計量資料比較采用Student-t檢驗進行。采用單因素方差分析（方差或協(xié)方差分析）對各組差異顯著性進行評估。方差分析的意義由F檢驗證實。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Kaplan-Meier法和Log rank檢驗進行生存終點分析。使用SPSS11統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 第1階段:不同治療方案對腫瘤壞死面積的影響及病理表現(xiàn)

TTC染色結(jié)果顯示，單獨RFA組腫瘤壞死范圍與free-VIN組之間無明顯差異，分別為（157.5± 51.5）mm2和（255.3±25.4）mm2（P＞0.05）。當(dāng)TLVIN的濃度從5 mg/kg提高至20 mg/kg，腫瘤壞死范圍存在劑量依賴的影響。TL-VIN（濃度5 mg/kg）組與單獨RFA組相比，腫瘤壞死面積增加，為（258.3± 45.1）mm2和（157.5±51.5）mm2（P=0.026），但與free-VIN組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各為（258.3± 45.1）mm2和（225.3±25.4）mm2（P＞0.05）。TL-VIN（濃度10mg/kg）組與單獨RFA組及free-VIN組相比，均增加了腫瘤的壞死面積，為（341.8±65.4）mm2和（157.5±51.5）mm2或（225.3±25.4）mm2（P= 0.001和P=0.007）。TL-VIN（濃度20 mg/kg）組與其他各組相比導(dǎo)致腫瘤的壞死面積更大，為（425.4± 53.4）mm2，但與TL-VIN（濃度10mg/kg）組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。由于TL-Vin聯(lián)合RFA組中兩只荷瘤小鼠在給予在20 mg/kg濃度條件下治療后死亡，因此選擇10 mg/kg為最佳濃度，進行后期試驗。

表1 各組腫瘤壞死范圍比較（曾±澤）

HE染色結(jié)果顯示，光鏡下可見消融區(qū)內(nèi)部凝固性壞死，部分邊緣可見不可逆的細(xì)胞損傷和細(xì)胞變性混合。高倍鏡下進行觀察，邊緣處可見參差不齊的活性細(xì)胞島。與此相反，TL-VIN+RFA組的標(biāo)本可觀察到較大的腫瘤凝固性壞死區(qū)域，同時壞死區(qū)域周邊組織邊界清晰，未觀察到明顯漸變區(qū)（圖1）。

圖1 腫瘤凝固壞死邊緣的病理表現(xiàn)（HE染色）

2.2 第2階段:定量檢測瘤內(nèi)藥物濃度

TL-Vin組與free-Vin組相比，瘤內(nèi)藥物濃度明顯的增加，為（194.5±72.3）ng/ml和（74.7±10.5）ng/ m l，P=0.025。free-VIN組與free-VIN聯(lián)合RFA組比較，瘤內(nèi)的藥物濃度之間無明顯差異，為（74.7± 10.5）ng/ml和（95.5±26.5）ng/ml，P＞0.05；而TLVin聯(lián)合RFA組與TL-VIN組相比，瘤內(nèi)藥物的濃度顯著增加，為（1156.5±158.3）ng/m l和（194.5± 52.3）ng/m l，P=0.005。與free-VIN聯(lián)合/不聯(lián)合RFA治療相比，TL-Vin聯(lián)合RFA組瘤內(nèi)長春瑞濱藥物濃度增加約10倍（圖2）。

圖2 瘤內(nèi)長春瑞濱攝取濃度比較

2.3 第3階段:聯(lián)合治療對動物長期生存率的影響

單純RF組及free-VIN聯(lián)合RFA組荷瘤小鼠的平均生存期分別為（23.4±5.0）d和（23.3± 1.2）d，均高于對照組（17.5±2.5）d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TL-VIN聯(lián)合RFA組優(yōu)于單純RFA組，為（37.6±20.1）d和（23.4±5.0）d，P=0.018及free-VIN+RFA組，為（37.6±20.1）d和（23.3± 1.2）d（P=0.024），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。而單純RFA組與free-VIN聯(lián)合RFA組之間的平均生存期差異無統(tǒng)計學(xué)意義，為（23.4±5.0）d和（23.3± 1.2）d（P＞0.05）。在TL-VIN+RFA組中有1個腫瘤得到局部控制，長期無瘤生存，但其他組均沒有腫瘤得到長期局部控制（圖4）。

圖3 H22腫瘤治療后終點生存率比較

圖4 不同的治療方法后大體腫瘤的局部控制與轉(zhuǎn)歸

3 討論

RFA治療小肝癌的療效不斷提高，已經(jīng)廣泛被接受為治療小肝癌的重要手段。但有文獻報道，對于直徑＞3 cm的腫瘤，在消融重疊區(qū)仍可能有腫瘤細(xì)胞存活［4］。近年來，多有報道常規(guī)脂質(zhì)體化療藥如阿霉素可有效提高熱消融腫瘤壞死范圍及動物生存期［5-6］。最近，隨著藥物傳遞體系的進一步發(fā)展，新型熱敏脂質(zhì)體藥物可能成為RFA聯(lián)合治療的最佳選擇。這種新型藥物載體是否能被熱消融加速藥物是否，形成提高局部濃度并提高療效，是本研究的重點［7］。

長春瑞濱是長春堿半合成衍生物，為廣譜抗腫瘤藥物，廣泛應(yīng)用于實體腫瘤的治療。熱敏脂質(zhì)體主要通過改變溫度進而改變脂質(zhì)雙層的磷脂組成，從而在靶器官釋放藥物達到靶向治療的目的，具有明確的熱靶向性。將長春瑞濱制備成TL-VIN，并結(jié)合病變部位加熱（熱消融）來實現(xiàn)藥物的靶向投遞和在靶部位快速釋藥，有助增強其抗腫瘤的治療效果、降低不良反應(yīng)［8］。

本研究表明，TL-VIN聯(lián)合RFA治療腫瘤壞死面積明顯增加，長期觀察具有明顯的抑瘤作用，其抑瘤作用明顯優(yōu)于free-VIN聯(lián)合RFA組和單純RFA組。其原因可能是TL-VIN具有熱靶向性；同時加熱本身就可以使腫瘤對化療藥物更加敏感，有利于阻止腫瘤細(xì)胞DNA的自我修復(fù)［9］。同時本研究也顯示脂質(zhì)體長春瑞濱隨著濃度的提高（5 mg/kg至20 mg/kg），腫瘤壞死范圍存在劑量依賴的影響，而最終濃度需考慮療效與不良反應(yīng)的平衡，本研究選擇10mg/kg為最佳濃度。

測瘤體內(nèi)藥物濃度，TL-VIN組比free-VIN組和free-VIN聯(lián)合RFA組瘤內(nèi)藥物濃度增加了10倍以上。分析結(jié)果證實了加熱治療可提高腫瘤對TL-VIN的敏感性和靶向性。

本研究觀察到相比單純RFA、TL-VIN聯(lián)合RFA組的標(biāo)本顯示較大的無活性的凝固性壞死區(qū)域，邊界清晰，腫瘤壞死面積也明顯增加。這提示在RFA治療中，如果同時給予熱敏脂質(zhì)體化療藥物，藥物可以在壞死區(qū)的周圍濃聚，使該區(qū)域的腫瘤細(xì)胞得以殺死，從而可擴大RFA的治療范圍，減少腫瘤的殘存和復(fù)發(fā)［10］。

本研究證實單純RFA和free-VIN聯(lián)合RFA不能有效控制腫瘤，治療后腫瘤依然生長。只有RFA聯(lián)合TL-VIN具有很好的生存獲益。有文獻報道，局部加熱可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時也使熱敏脂質(zhì)體膜的流動性增大，這種結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致脂質(zhì)體的通透性發(fā)生改變，脂質(zhì)體內(nèi)部包封的藥物借助于跨膜濃度梯度而大量擴散到靶器官中，提高了腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的攝取，使藥物直接進入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，從而達到局部化療的作用［11］。保持了細(xì)胞內(nèi)較高的藥物濃度并降低了全身不良反應(yīng)。

本實驗的不足是實驗本身僅限于小鼠腫瘤模型，未在更多種類腫瘤模型中進行比較，同時也未能克服腫瘤生長中自發(fā)壞死對療效的觀察影響。因此在臨床應(yīng)用前，需要在更多的腫瘤模型中進一步證實，同時也需要嚴(yán)格的臨床試驗評價。

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Using thermosensitive chemotherapy agent to im prove the effect of radiofrequency ablation for liver tum ors：an animal experim ent

WANG Song，WENG Xie，GONG Wei，LEE Jung-chieh，WANG Yan- jie，MEIXing-guo，YANGWei.Key laboratory of Carcinogenesis and Translational Research（Ministry of Education），Department of Ultrasound，Peking University Cancer Hospital&Institute，Beijing 100142，China

YANG Wei，E-mail:weiwei02032001@gmail.com；MEI Xing-guo，E-mail: newdds@126.com

ObjectiveTo investigate the pathologic mechanism of radiofrequency ablation（RFA）combined with intravenous infusion of thermosensitive liposome encapsulated vinorelbine（TL-Vin）in treating liver tumors，and to analyze the effect of combination therapy on the long-term survival rate.MethodsH22 liver adenocarcinoma tissue was subcutaneously implanted into ICR mice to establish the animal models.At the first experimental period，40mice were random ly and equally divided into 5 groups to

ifferent therapeutic scheme（using different TL-Vin concentrations）.Twenty-four hours after the treatment the tumor specimens were collected，the necrotic areas were measured separately，and the optimal TL-Vin concentration was determined.At the second experimental period，13 mice were random ly selected to receive treatment.Half an hour after the treatment the tumor tissueswere collected and the TL-Vin concentration within the tumor was determined.At the third experimental period，32mice were randomly and equally divided into 4 groups，and 90 days after treatment the tumor growth curve was drawn.The survival rate was compared between each other of the groups.ResultsCompared with pure RFA group，TL-Vin+RFA significantly increased tumor coagulation extent（P＜0.01）.But free-VIN+RFA had similar tumor necrotic extent as that produced by RFA alone（P＞0.05）.Tumor coagulation area in TL-Vin+RFA group was bigger than that in free-VIN+RFA group at the concentration of 10 mg/kg［（341.8±65.4）mm2vs（225.3±25.4）mm2，P＜0.01］.In TL-Vin group the coagulationmargin was clear.Themean intratumoral Vinorelbine accumulation in TL-Vin+RFA group was 10 folds of that in free-Vin group［（1 156.5±158.3）ng/m l vs（194.5±52.3）ng/m l，P=0.005］.TL-Vin+ RFA had better survival result than thatof RFA alone（37.6±20.1 days vs.23.4±5.0 days，P=0.015），as well as than that of free-Vin+RFA［（37.6±20.1）days vs（23.3±1.2）days，P=0.016］.ConclusionThermosensitive liposomal chemotherapies（Vinorelbine）can be selectively delivered at the edge of RFA coagulation area and thus effectively increase RFA-induced tumor coagulation and prolong the end-point survival in experimentalmice.（J Intervent Radiol，2014，23:506-510）

radiofrequency ablation；liver tumor；thermosensitive liposome；antineoplastic drug；combination therapy

R735.7

B

1008-794X（2014）-06-0506-05

2014-02-24）

（本文編輯:俞瑞綱）

10.3969/j.issn.1008-794X.2014.06.012

國家自然科學(xué)青年基金（81101745）；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)計劃（2013-3-086）

100142北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所超聲科，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室（王凇、翁勰、李榮杰、王延杰、楊薇）；南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院感染科暨肝病中心（翁勰）；中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所（龔偉、梅興國）

楊薇E-mail:weiwei02032001@gmail.com；梅興國E-mail:newdds@126.com