韓聚強(qiáng)，范公忍，任永強(qiáng)，郭漢斌，李國(guó)安，夏長(zhǎng)虹，王帥，龔麗娟，曹建彪

·腫瘤介入Tumor intervention·

不同微創(chuàng)介入治療原發(fā)性肝癌對(duì)機(jī)體T細(xì)胞免疫功能的影響

韓聚強(qiáng)，范公忍，任永強(qiáng)，郭漢斌，李國(guó)安，夏長(zhǎng)虹，王帥，龔麗娟，曹建彪

目的探討微創(chuàng)介入治療肝癌對(duì)機(jī)體T細(xì)胞免疫功能的影響。方法肝動(dòng)脈栓塞化療（TACE）治療肝癌31例，射頻消融（RFA）治療肝癌19例，根據(jù)腫瘤直徑大小分為小肝癌組（直徑≤5 cm）和大肝癌組（直徑＞5 cm）。分別于術(shù)前及術(shù)后1、7 d留置外周血，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值的變化。結(jié)果小肝癌組，TACE與RFA治療術(shù)后1 d外周血T細(xì)胞亞群無(wú)明顯變化，但術(shù)后7 d時(shí)，RFA治療組外周血T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值較治療前相比明顯增高，而TACE組外周血T細(xì)胞亞群CD4及CD4/CD8比值較治療前明顯下降。大肝癌組，無(wú)論TACE還是RFA治療，術(shù)后1 d外周血T細(xì)胞亞群指標(biāo)較治療前明顯下降（P＜0.05），而7 d后外周血T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值較治療前顯著增高，其中RFA組T細(xì)胞亞群較TACE組恢復(fù)更為顯著。結(jié)論不同微創(chuàng)治療方式治療肝癌后對(duì)機(jī)體T細(xì)胞免疫系統(tǒng)影響不同，與腫瘤大小密切相關(guān)。

肝細(xì)胞癌；肝動(dòng)脈栓塞化療術(shù)；射頻消融治療術(shù)；免疫功能

近年諸多研究證實(shí)，肝動(dòng)脈栓塞化療（TACE）治療乙型肝炎相關(guān)肝癌術(shù)后會(huì)出現(xiàn)乙型肝炎病毒（HBV）反彈［1］。我們前期工作也已證實(shí)，TACE及射頻消融（RFA）治療均可導(dǎo)致HBV反彈，其中腫瘤直徑大小為單獨(dú)影響因素。綜上推測(cè)，上述現(xiàn)象可能與微創(chuàng)介入治療術(shù)后機(jī)體免疫功能改變有關(guān)［2］?；诖?，我們將肝臟腫瘤直徑大小分作為分層分析依據(jù)，進(jìn)一步觀察了TACE治療31例和RFA治療19例后對(duì)機(jī)體T細(xì)胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料2012年6月至于12月在北京軍區(qū)總醫(yī)院肝病科住院接受治療的HBV相關(guān)肝癌患者50例，所有患者均行肝穿活檢病理證實(shí)為肝細(xì)胞性肝癌。其中男45例，女5例，年齡28～72歲，平均年齡55歲。肝功能Child-Pugh分級(jí)A級(jí)41例，B級(jí)9例。治療前接受核苷類抗病毒治療39例（規(guī)范服藥療程均在3個(gè)月以上），未接受治療11例。所有患者根據(jù)腫瘤直徑大小劃分為小肝癌（直徑≤5 cm）和大肝癌（直徑＞5 cm）組。

1.1.2 主要試劑及儀器淋巴細(xì)胞分離液（Ficollhypque液）:天津TBD生物技術(shù)發(fā)展中心；IgGr1-FITC/IgGr2a-PE、CD3-FITC/CD4-PE、CD3-FITC/ CD8-PE和FACS Lysing Solution溶血素:BD公司生產(chǎn)；流式細(xì)胞儀（FCM）Calibur:BD公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 TACE（31例）采用Seldinger改良技術(shù)，經(jīng)皮右股動(dòng)脈穿刺將導(dǎo)管選擇性插入肝固有動(dòng)脈或超選擇性插入到腫瘤供血靶動(dòng)脈后，造影觀察腫塊大小、部位及血供情況?；煼桨覆捎眠寥岜刃牵?0～40 mg），奧沙利鉑（50～100 mg）、5-氟尿嘧啶（500 mg）。以適當(dāng)速度注入上述藥物與液態(tài)碘化油的混合物，再注入明膠海綿顆粒進(jìn)行栓塞，將靶動(dòng)脈閉塞。

1.2.2 RFA（19例）患者術(shù)前禁食、肌注鹽酸哌替啶25mg、鹽酸異丙嗪25 mg，于常規(guī)腹部B超引導(dǎo)下將RFA電極準(zhǔn)確刺入腫瘤部位，張開(kāi)多個(gè)子電極呈傘形鎖定腫瘤。RFA儀在計(jì)算機(jī)控制下發(fā)出射頻脈沖，使腫瘤組織產(chǎn)生局部高溫（70℃～95℃）。

1.2.3 FCM檢測(cè)CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值分別于術(shù)前及術(shù)后1、7 d抽取患者血樣，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離外周血中有核細(xì)胞，外周血中有核細(xì)胞染色標(biāo)記30 min，溶血10 min，300 g離心5 min，棄上清液，PBS洗2次，隨后上機(jī)檢測(cè)，并采用Cellquest軟件進(jìn)行樣品測(cè)定分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel 2007建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢測(cè)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較

根據(jù)腫瘤直徑大小將所檢測(cè)樣本進(jìn)行分層，RFA組和TACE治療組中肝癌大小患者之間性別構(gòu)成、年齡、血清AFP水平、肝功能Child-Pugh分級(jí)、包膜完整性及腫瘤病理學(xué)分級(jí)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 不同微創(chuàng)介入治療原發(fā)性肝癌后肝功能損傷的比較

不管RFA還是TACE治療，大肝癌治療后近期肝功能的損傷明顯高于小肝癌組?？v向比較發(fā)現(xiàn)，無(wú)論大肝癌還是小肝癌組，TACE對(duì)肝臟功能的近期損傷明顯高于RFA組。見(jiàn)表1、表2。

表1 RFA治療原發(fā)性肝癌前后肝功能損傷變化（±s）

表1 RFA治療原發(fā)性肝癌前后肝功能損傷變化（±s）

注:a各組術(shù)后與治療前相比，P＜0.05；b各組術(shù)后與治療前相比，P＜0.01

組別ALT/（u/L）TBIL/（μmol/L）ALB/（g/L）AST/（u/L）腫瘤直徑≤5 cm（9例）術(shù)前43.15±4.42 26.18±6.45 32.49±8.23 46.28±3.62術(shù)后1 d 48.49±5.21a25.43±7.29 33.14±5.45 45.23±6.32術(shù)后7 d 42.26±6.38 24.96±7.42 31.99±6.45 45.75±8.14腫瘤直徑＞5 cm（10例）術(shù)前60.12±10.35 36.58±7.24 31.25±7.33 66.48±8.39術(shù)后1 d 98.34±9.21b45.43±8.34b29.44±6.87 74.38±10.12b術(shù)后7 d 69.18±8.48a39.77±6.49a30.92±7.18 55.78±9.36a

2.3 不同微創(chuàng)介入治療后外周血細(xì)胞免疫功能的比較

2.3.1 RFA治療原發(fā)性肝癌前后外周血T細(xì)胞亞群的變化小肝癌組，RFA治療1 d后外周血T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值均無(wú)明顯變化，而7 d后外周血T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值均較治療前相比明顯增高（P＜0.05）。大肝癌組，RFA治療1 d后外周血T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值較治療前明顯下降（P＜0.05），而7 d后外周血T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值與治療前比較明顯增高（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表2 TACE治療原發(fā)性肝癌前后肝功能損傷變化（±s）

表2 TACE治療原發(fā)性肝癌前后肝功能損傷變化（±s）

注:a各組術(shù)后與治療前相比，P＜0.05；b各組術(shù)后與治療前相比，P＜0.01

組別ALT TBIL ALB AST腫瘤直徑≤5 cm（20例）術(shù)前44.34±5.79 22.47±4.68 33.14±5.73 46.34±6.42術(shù)后1 d 56.24±5.91a23.54±6.17 31.89±6.94 47.21±4.39術(shù)后7 d 45.35±7.43 23.14±8.77 32.37±6.54 45.28±0.34腫瘤直徑＞5 cm（11例）術(shù)前54.83±7.45 30.63±5.29 31.85±5.96 64.39±9.22術(shù)后1 d 153.18±20.91b49.52±7.47b27.89±7.74a127.45±14.45b術(shù)后7 d 75.59±9.16a39.51±9.17a29.01±6.51a75.58±7.94a

表3 RFA治療原發(fā)性肝癌前后外周血T細(xì)胞亞群變化（±s）

表3 RFA治療原發(fā)性肝癌前后外周血T細(xì)胞亞群變化（±s）

注:a各組術(shù)后與治療前相比，P＜0.05；b各組術(shù)后與治療前相比，P＜0.01

組別CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+腫瘤直徑≤5 cm（9例）術(shù)前63.15±10.24 27.92±7.34 24.09±6.56 1.08±0.34術(shù)后1 d 62.97±9.31 29.02±6.53 23.66±5.34 1.10±0.41術(shù)后7 d 64.46±10.38 37.38±6.85a22.89±5.79a1.63±0.44a腫瘤直徑＞5 cm（10例）術(shù)前53.15±6.18 26.33±5.76 24.32±5.42 1.17±0.38術(shù)后1 d 51.84±7.21 24.35±4.89a22.63±6.04a0.94±0.34a術(shù)后7 d 52.16±5.44 33.38±5.73b27.56±5.83b1.43±0.52b

2.3.2 TACE治療原發(fā)性肝癌前后外周血T細(xì)胞亞群的變化小肝癌組，TACE治療1 d后外周血T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值均無(wú)明顯變化，而7 d后外周血T細(xì)胞亞群CD4及CD4/ CD8比值較治療前相比明顯下降（P＜0.05）。大肝癌組，TACE治療1 d后外周血T細(xì)胞亞群CD3、CD4及CD4/CD8比值較治療前明顯下降（P＜0.01），但7 d后外周血T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值較治療1 d后有所升高，但較治療前仍有所下降（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.4 不同微創(chuàng)介入治療肝癌后外周血CD4/CD8比值的變化

以CD4/CD8細(xì)胞比值為中心的免疫調(diào)節(jié)是機(jī)體維持免疫平衡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們以腫瘤直徑大小進(jìn)行分層分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn):①小肝癌組，經(jīng)TACE治療后CD4/CD8細(xì)胞比值呈輕微下降趨勢(shì)，而RFA治療后CD4/CD8細(xì)胞比值呈明顯上升的趨勢(shì)。在治療后第7天，RFA治療組CD4/CD8細(xì)胞比值顯著高于TACE治療組（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。②直徑大于5 cm的肝癌，兩種微創(chuàng)介入治療后CD4/CD8細(xì)胞比值均呈先下降再逐漸升高的趨勢(shì)，但在治療后第7天，RFA治療后CD4/CD8細(xì)胞比值恢復(fù)上升趨勢(shì)同樣顯著高于TACE治療組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

表4 TACE治療原發(fā)性肝癌前后外周血T細(xì)胞亞群變化（±s）

表4 TACE治療原發(fā)性肝癌前后外周血T細(xì)胞亞群變化（±s）

注:a各組術(shù)后與治療前相比，P＜0.05；b各組術(shù)后與治療前相比，P＜0.01

組別CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+腫瘤直徑≤5 cm（20例）術(shù)前64.24±8.34 29.12±6.54 29.33±5.86 1.07±0.42術(shù)后1 d 63.97±5.91 28.54±7.32 28.65±4.89 1.03±0.39術(shù)后7 d 64.35±6.83 27.38±6.77a28.89±6.87 0.98±0.34a腫瘤直徑＞5 cm（11例）術(shù)前54.32±7.15 26.12±4.54 23.41±7.24 1.20±0.35術(shù)后1 d 43.97±5.91b19.44±7.32b23.19±3.67 0.87±0.29b術(shù)后7 d 46.35±6.83a22.38±6.77a22.15±3.23a1.03±0.42a

圖1 不同微創(chuàng)治療小肝癌后外周血CD4/CD8比值的變化

圖2 不同微創(chuàng)治療大肝癌后外周血CD4/CD8比值的變化

3 討論

機(jī)體免疫功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，其中T細(xì)胞免疫在機(jī)體抗腫瘤的免疫調(diào)節(jié)中重要作用［3］。臨床上通過(guò)測(cè)定CD4、CD8等T細(xì)胞數(shù)值以及CD4/CD8細(xì)胞比值來(lái)判斷機(jī)體維持免疫平衡狀態(tài):當(dāng)CD4細(xì)胞下降、CD4/CD8比值下降或CD8上升時(shí)，機(jī)體免疫功能下降；相反，當(dāng)CD4細(xì)胞上升、CD4/CD8比值上升或CD8下降時(shí)，則提示機(jī)體免疫功能好轉(zhuǎn)或恢復(fù)。

介入治療是近年興起治療肝癌的有效微創(chuàng)方法，包括TACE、RFA等，其對(duì)于小肝癌或早期肝癌的療效相當(dāng)顯著［4］，但介入治療對(duì)機(jī)體免疫功能的影響目前觀點(diǎn)不一。比如TACE，單純從治療本身分析，肝癌供血?jiǎng)用}栓塞后，腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死，因此其釋放的腫瘤抑制因子減少，從而減弱了對(duì)機(jī)體免疫功能的抑制［5］。但有臨床研究表明，肝動(dòng)脈栓塞化療后機(jī)體的免疫功能顯著降低［6-7］。究其原因，大部分肝癌患者就診時(shí)已到中晚期，多為巨塊型肝癌，或存在血管受壓移位、變異，很難做到主要載瘤動(dòng)脈的栓塞，因此栓塞化療的同時(shí)，部分正常肝組織受損明顯，而目前已證實(shí)，肝臟是機(jī)體最大的免疫器官，因此過(guò)分的栓塞化療可能是導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降的主要原因。這一點(diǎn)在我們的研究結(jié)果中也得到很好的體現(xiàn)。相反，目前多項(xiàng)研究提示RFA治療能夠增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能［8-9］，具體機(jī)制目前尚不明了，分析原因可能如下:①RFA治療后引起部分或全部腫瘤變性壞死，一定程度上減輕了腫瘤負(fù)荷，消除了體內(nèi)腫瘤免疫抑制因子來(lái)源，解除了對(duì)宿主免疫抑制作用。②RFA治療后，變性壞死的腫瘤細(xì)胞暴露其表面腫瘤抗原決定簇，增強(qiáng)了免疫原性，刺激產(chǎn)生特異性和非特異性抗腫瘤免疫，從而改善機(jī)體的免疫功能。③加溫是一種物理性的損傷因素，可引起非特異性炎性反應(yīng)，同樣可以刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)。④高溫?zé)岑熆梢源龠M(jìn)腫瘤組織合成一種熱休克蛋白，其在細(xì)胞內(nèi)形成復(fù)合物，從而被T淋巴細(xì)胞識(shí)別，產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。⑤RFA治療產(chǎn)物高溫可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)P53蛋白穩(wěn)定性增加，同時(shí)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡基因或自噬基因表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步減輕了瘤負(fù)荷［10］。

隨著微創(chuàng)介入治療技術(shù)的成熟，目前臨床上也逐漸擴(kuò)大了TACE或RFA治療肝癌的適應(yīng)證，由原來(lái)的小肝癌向大肝癌、單一介入技術(shù)到多種介入技術(shù)及微創(chuàng)介入治療與全身靶向治療的聯(lián)合［11］。理論上，上述聯(lián)合具有很好的依據(jù)。此外，在治療過(guò)程中除了關(guān)注對(duì)腫瘤的毀損效果外，人們也越來(lái)越注意到各種影響因素對(duì)微創(chuàng)治療療效的影響以及微創(chuàng)治療本身對(duì)全身免疫系統(tǒng)的影響。本研究中，我們將腫瘤大小作為影響因素進(jìn)行了分層分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤大小在評(píng)估微創(chuàng)介入治療對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響極大。鑒于此次研究的樣本量相對(duì)較少，我們目前仍在繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步探討微創(chuàng)介入對(duì)機(jī)體免疫功能的影響及分子機(jī)制，為將來(lái)微創(chuàng)介入治療方案的優(yōu)化組合提供理論依據(jù)。

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The influence of different m icro-injury interventional treatments on the T lymphocyte immune function in patients w ith primary hepatocellular carcinoma

HAN Ju-qiang，F(xiàn)AN Gong-ren，REN Yong-qiang，GUO Han-bin，LIGuo-an，XIA Chang-hong，WANG Shuai，GONG Li-juan，CAO Jian-biao. Institute of Liver Disease，General Hospital of Beijing Military Region，Beijing 100700，China

HAN Ju-qiang，E-mail:hanjq@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the influence of differentmicro-injury interventional treatments on the T lymphocyte immune function in patientswith primary hepatocellular carcinoma（HCC）.M ethods A total of 50 patients with pathologically-proved HCC were enrolled in this study.Transcatheter arterial chemoembolization（TACE）was carried out in 31 patients，while radiofrequency ablation（RFA）was performed in 19 patients.According to the tumor’s diameter，the patients were divided into small HCC group（≤5 cm）and larger HCC group（＞5 cm）.Peripheral blood was taken before and one，seven days after the treatment to determine CD3，CD4，CD8 as well as the ratio of CD4/CD8 using flow cytometry assay.The results were analyzed.ResultsOne day after either TACE or RFA treatment in small HCC group，T lymphocytes in peripheral blood，including CD3，CD4，CD8 as well as the ratio of CD4/CD8，were kept at the same levels as before.However，seven days after the treatment T lymphocytes（including CD3，CD4，CD8 as well as the ratio of CD4/CD8）were significantly increased in RFA group，while T lymphocytes were obviously decreases in TACE group.One day after either TACE or RFA treatment in larger HCC group，T lymphocytes showed a remarkable decrease in both groups（P＜0.05），while seven days after the treatment T lymphocytes and the ratio of CD4/CD8 increased significantly，especially in RFA group.ConclusionThe differentmicro-injury interventional treatments carry different influences on the T lymphocyte immune function in patients with primary hepatocellular carcinoma，which may be related to the size of tumor.（J Intervent Radiol，2014，23:218-221）

hepatocellularcarcinoma；transcatheter arterial chemoembolization；radiofrequency ablation；immunological function

R735.7

A

1008-794X（2014）-03-0218-04

2013-08-20）

（本文編輯:俞瑞綱）

國(guó)家自然科學(xué)基金（30972594）；王寶恩肝纖維化基金（2010-14）

10.3969／j.issn.1008-794X.2014.03.009

100700北京北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍肝病中心

韓聚強(qiáng)E-mail:hanjq73＠hotmail.com