鄭紀(jì)偉，孫 沖，周 潔，何開躍，何旭東*

（1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153；2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037）

柳樹DNA提取改良方法研究

鄭紀(jì)偉1，2，孫 沖1，2，周 潔1，何開躍2，何旭東1*

（1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153；2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037）

高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行林木分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)與關(guān)鍵。該研究利用改良的CTAB法提取垂柳基因組DNA，并與常規(guī)CTAB法、CTAB－硅珠裂解法、SDS法和試劑盒法進(jìn)行了比較。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，改良CTAB法提取的DNA濃度和純度較高，質(zhì)量優(yōu)于其他4種提取方法。同時(shí)利用改良CTAB法提取了柳樹16個(gè)自然種及雜交種基因組DNA，并經(jīng)SSR－PCR擴(kuò)增反應(yīng)驗(yàn)證，表明改良CTAB法可作為一種柳樹基因組DNA提取的通用方法。

柳樹；DNA提取；改良CTAB法

柳樹屬于楊柳科（Salicaceae），是柳屬（Salix）和鉆天柳屬（Chosenia）的通稱。通常所說的柳樹主要是指柳屬包括的所有樹種。目前全世界共有520種以上，我國有257種、122個(gè)變種，大多數(shù)屬于灌木（190種以上）。作為發(fā)葉早、落葉晚的闊葉樹之一，柳樹自古以來就是重要的園林造景綠化樹種［1］；柳樹生長快，是平原地區(qū)重要的速生用材林樹種，具有較高的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［2］；柳樹光能利用率高、適應(yīng)性強(qiáng)、栽培和更新容易，被國際上廣泛應(yīng)用于能源林建設(shè)，目前已經(jīng)成為溫帶和亞熱帶地區(qū)最重要的能源樹種［3］。由于柳樹基因組不大，生長迅速且易于無性繁殖，亦可作為遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究的模式樹種［4］。

DNA提取是林木分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。利用高效快速的提取方法獲得高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行柳樹分子標(biāo)記開發(fā)、種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析及QTL定位的關(guān)鍵所在。盡管前期已有單個(gè)柳樹樹種DNA提取方法的報(bào)道，如利用CTAB法和試劑盒法對(duì)蒿柳［5］、白柳［6］和爆竹柳［6］等進(jìn)行DNA提取，然而柳樹種類繁多，不同個(gè)體之間存在較大差異，在實(shí)際操作過程中發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的柳樹DNA提取方法對(duì)某些柳樹樹種并不適宜。本研究將對(duì)原有提取方法進(jìn)行優(yōu)化改良，并與CTAB法、CTAB-硅珠裂解法、SDS法和試劑盒法進(jìn)行比較，并利用柳樹多個(gè)自然種及雜交種進(jìn)行檢測(cè)，以期找到一種適合柳樹基因組DNA提取的通用方法，為柳樹分子生物學(xué)的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

5種提取方法對(duì)比材料為垂柳，采集地為江蘇省南京市玄武湖公園。柳樹多樹種提取材料為8個(gè)喬木柳和8個(gè)灌木柳。喬木柳為鉆天柳、腺柳、旱柳、朝鮮柳、黑柳、白柳、蘇柳172和蘇柳795，灌木柳為歐洲紅皮柳、蒿柳、蘇柳52-2、黃花柳、綿毛柳、蘇柳2345、杞柳和簸箕柳（見表1）。采集地點(diǎn)為江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院種質(zhì)資源圃內(nèi)。采集當(dāng)年生幼嫩的葉片，于－70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 16個(gè)柳樹自然種及雜交種

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取方法 CTAB法參照文獻(xiàn)［7］；CTAB硅珠-裂解法參照文獻(xiàn)［8］；SDS法參考文獻(xiàn)［9］；試劑盒法采用QIAGEN的植物基因組DNA提取試劑盒（DP305），按操作說明進(jìn)行；改良CTAB法，即在CTAB法的基礎(chǔ)上，增加氯仿-異戊醇的抽提次數(shù)，同時(shí)利用硅珠懸浮液與核酸結(jié)合，并用漂洗液對(duì)硅珠核酸復(fù)合物進(jìn)行漂洗去污。具體步驟如下：

①稱取新鮮葉樣1.2 g左右，去中脈，放入預(yù)冷的研缽中，倒入液氮迅速研磨至粉末狀，迅速將樣品轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中；

②向離心管中加入4 mL 65℃預(yù)熱的CTAB提取液，充分混勻后65℃水浴45 min左右，每10 min上下顛倒混勻1次；

③取出樣品管，4℃下12 000 r／min（16 000× g）離心10 min，取上清液；

④加入等體積氯仿∶異戊醇（體積比24∶1）搖勻，4℃下12 000 r／min（16 000×g）離心10 min，取上清液，重復(fù)3次；

⑤向上清液中加入－20℃冷藏的、等體積的異丙醇，輕輕晃動(dòng)混勻，靜置過夜；

⑥加入400 μL硅珠懸浮液，充分混勻靜置10 min，4℃下12 000 r／min（16 000×g）離心5 min；

⑦棄上清，向沉淀中加入1 mL異硫氰酸胍漂洗液，用75%和95%酒精各洗滌1次，自然條件下在通風(fēng)廚中風(fēng)干沉淀物；

⑧加入1×TE 300 μL，沉淀浸泡5～10 min，過程中彈動(dòng)或振蕩以充分溶解DNA；

⑨14 000 r／min（22 000×g）離心5 min，取上清液，將溶液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，－80℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA質(zhì)量的檢測(cè) 取2 μL的DNA提取液和4 μL的溴酚藍(lán)混合之后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，通過Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.3 SSR-PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè) SSR-PCR反應(yīng)體系、PCR程序及擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)參考文獻(xiàn)［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA不同提取方法比較

利用CTAB硅珠-裂解法、CTAB法、改良CTAB法、QIAGEN試劑盒法和SDS法分別提取垂柳基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。5種提取方法均能得到完整的DNA條帶，其中第1種CTAB硅珠-裂解法得到的條帶較淡，說明DNA濃度較低；第2種CTAB法得到的條帶存在明顯的拖尾現(xiàn)象，說明在提取過程中DNA發(fā)生了降解，且可能存在RNA的污染；第4種QIAGEN試劑盒法在點(diǎn)樣孔有一定亮度，說明DNA樣品中存在蛋白質(zhì)及多糖等雜質(zhì)，輕微拖尾現(xiàn)象說明DNA發(fā)生了部分降解；第5種SDS法得到的DNA與第1種方法類似，條帶較淡，說明DNA濃度較低；而第3種改良CTAB法得到的電泳條帶清晰、整齊、單一明亮，無拖尾且點(diǎn)樣孔無發(fā)亮現(xiàn)象，說明DNA濃度較高、質(zhì)量較純，無蛋白質(zhì)、多糖雜質(zhì)殘留，且無RNA污染。可見這5種方法中改良CTAB法提取的效果最好，SDS法及CTAB硅珠－裂解法次之，CTAB法及QIAGEN試劑盒法效果最差。

2.2 柳樹多樹種DNA提取

利用改良CTAB法提取8個(gè)喬木柳和8個(gè)灌木柳不同自然種及雜交種的基因組DNA，其電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。在16個(gè)柳樹自然種及雜交種中均得到了單一、明亮的DNA條帶，且無雜質(zhì)污染，說明改良CTAB法可作為一種適合柳樹基因組DNA提取的通用方法。

圖1 5種不同DNA提取方法電泳結(jié)果對(duì)比

圖2 16個(gè)柳樹品種DNA的瓊脂糖電泳檢測(cè)

2.3 SSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果

以改良CTAB法提取的16個(gè)柳樹自然種及雜交種基因組DNA為模板，并選取一對(duì)垂柳CLeSSR013引物進(jìn)行SSR-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果見圖3。由圖3可見，16個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均得到了單一且明亮的條帶，無雜帶且目的片段大小均在100～500 bp，進(jìn)一步說明改良CTAB法提取的柳樹基因組DNA能很好的滿足PCR擴(kuò)增要求。

圖3 垂柳CLeSSR013引物在16個(gè)種及雜交種間的PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)

3 結(jié)論與討論

基因組DNA的提取是林木分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，也是必需環(huán)節(jié)。林木因其生長周期較長，次生代謝產(chǎn)物含量較高，蛋白質(zhì)、多糖、酚類等物質(zhì)的集聚給DNA提取增加了難度。柳樹種類繁多，個(gè)體差異較大，提取材料的來源、部位、形態(tài)等外在性質(zhì)和化學(xué)成分、組織結(jié)構(gòu)等內(nèi)在特點(diǎn)的差異，嚴(yán)重影響DNA提取的效果。因此，宜選用當(dāng)年生幼嫩的葉片作為提取材料，且在取樣后應(yīng)及時(shí)放入超低溫冰箱冷凍保存，以防止材料氧化褐變?cè)斐蒁NA降解。

在提取過程中，氯仿－異戊醇的抽提有利于去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，但抽提次數(shù)會(huì)影響DNA的得率［11］。抽提次數(shù)過多，會(huì)損失部分DNA；抽提次數(shù)過少，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不易去除。本研究經(jīng)反復(fù)多次試驗(yàn)，確定抽提3次時(shí)效果最佳。同時(shí)為了更好地降低多糖及多酚等雜質(zhì)干擾，本試驗(yàn)結(jié)合硅珠吸附法加入硅珠懸浮液并用異硫氰酸胍漂洗液進(jìn)行洗滌，得到了質(zhì)量較純的DNA。

綜上所述，改良CTAB法提取的垂柳DNA濃度及純度均優(yōu)于其他4種提取方法，且適用于柳樹其他樹種基因組DNA的提取，并能很好地滿足后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)的要求，可作為一種柳樹基因組DNA提取的通用方法。

［1］ 施士爭.柳樹的園林應(yīng)用類型與改良［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，23（4）：200-204.

［2］ 涂忠虞.柳樹育種與栽培［M］.南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1982：7.

［3］ Volka T A，Abrahamson L P，Nowaka C A，et a1.The development of short-rotation willow in the northeastern United States for bioenergy and bioproducts，agroforestry and phyto-remediation［J］.Biomass and Bioenergy，2006，30（8／9）：715-727.

［4］ Hanley S，Mallott M，Karp A.Alignment of aSalixlinkage map to thePopulus genomic sequence reveals macrosynteny between willow and poplar genomes［J］.Tree Genetics and Genomes，2006，3（1）：35-48.

［5］ Alstrom-Rapaport C，Lascoux M，Wang Y C，et al.Identification of a RAPD marker linked to sex determination in the basket willow（Salix viminalisL.）［J］.Journal of Heredity，1998，89（1）：44-49.

［6］ Triest L，De Greef B，De Bondt R，et al.RAPD of controlled crosses and clones from the field suggests that hybrids are rare in theSalix alba-Salix fragiliscomplex［J］.Heredity，2000，84（5）：555-563.

［7］ 何旭東.桉樹雜種優(yōu)勢(shì)及其分子標(biāo)記輔助選擇育種［D］.南京：南京林業(yè)大學(xué)，2010：57.

［8］ 張 博，張 露，諸葛強(qiáng)，等.一種高效的樹木總DNA提取方法［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，28（1）：13-16.

［9］ 單 志，吳宏亮，陳 偉，等.改良SDS法提取多種植物基因組DNA研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（8）：113-115.

［10］鄭紀(jì)偉.柳樹轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序及SSR標(biāo)記開發(fā)研究［D］.南京：南京林業(yè)大學(xué)，2013：29.

［11］陸嘉惠，李學(xué)禹，馬 淼，等.甘草屬植物DNA提取方法研究［J］.生物技術(shù)，2006，16（3）：45-47.

A modified method of DNA extraction from Salix

ZHENG Ji-wei1，2，SUN Chong1，2，ZHOU Jie1，HE Kai-yue2，HE Xu-dong1*

（1.Jiangsu Academy of Forestry，Nanjing 211153，China；2.College of Forestry Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China）

High quality DNA is critical in the study of forest molecular biology.In the present study，a method of DNA extraction from Salix babylonica was modified and compared with regular CTAB method，CTAB-silicon bead cracking method，SDS method and DNA extraction kit method.Agarose gel electrophoresis result showed that the concentration and purity of extracted DNA were superior to the other four methods by using modified CTAB method.Through the validation of extraction from 16 species and hybrids of Salix and amplification of SSR-PCR，we concluded that the modified CTAB method could be universal for genomic DNA extraction of Salix sp.

Salix；DNA extraction；Modified CTAB method

S792.12

A

10.3969／j.issn.1001－7380.2014.06.002

1001－7380（2014）06－0004－03

2014-09-15；

2014-10-15

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“垂柳全長CDNA文庫的構(gòu)建及功能標(biāo)記的開發(fā)”（BK2011871）；江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院青年基金項(xiàng)目“國內(nèi)楊柳科主栽品種指紋圖譜的構(gòu)建”（Y0003）

鄭紀(jì)偉（1986－），男，河南嵩縣人，碩士，主要從事植物學(xué)研究。

*通信作者：何旭東（1981－），男，江蘇句容人，助理研究員，博士，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail：hxd－519＠163.com。