吳佩春， 王海濤， 劉亞男， 信艷娟， 曹旭鵬， 薛 松?

中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，海洋生物產(chǎn)品工程組，遼寧大連116023

海綿中石油降解微生物的分離篩選及降解特性研究

吳佩春1， 王海濤1， 劉亞男1， 信艷娟1， 曹旭鵬1， 薛 松1?

中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，海洋生物產(chǎn)品工程組，遼寧大連116023

從大連灣原油污染海域生長(zhǎng)的海綿中分離篩選到一株原油降解菌OA58，根據(jù)其生長(zhǎng)形態(tài)、培養(yǎng)特征、16S rRNA序列相似性比對(duì)分析和生化指標(biāo)檢測(cè)，初步鑒定為脫葉鏈霉菌（Streptomyces exfoliatus）。同時(shí)，考察了該鏈霉菌對(duì)原油的降解效果，OA58能以原油為唯一碳源生長(zhǎng)，在人工海水培養(yǎng)基中，14 d內(nèi)對(duì)原油（初始濃度為1 g／L）的平均降解率為83%，是一株具有開發(fā)潛力的原油降解放線菌。

原油；海綿；鑒定；生物降解

近年來(lái)，海上石油開發(fā)活動(dòng)頻繁，運(yùn)輸過(guò)程中造成的海上溢油事故時(shí)有發(fā)生，給海洋環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，極大地破壞了海洋的生態(tài)平衡。為應(yīng)對(duì)溢油事故的發(fā)生及日后的環(huán)境修復(fù)［1，2］，目前，利用微生物降解石油被認(rèn)為是處理海洋石油污染最環(huán)保的方法之一［3～6］。對(duì)于石油降解微生物的研究，人們已經(jīng)從近海環(huán)境擴(kuò)展到大西洋、極地等極端環(huán)境［7～9］，這些降解微生物主要是從海水或海泥等樣品中分離得到的。

海綿作為低等的濾食性海洋動(dòng)物，體內(nèi)富集了豐富的海洋微生物。有些微生物與海綿互利共生，形成海綿共生微生物，這些共生微生物不僅能為海綿提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量［10］，還可通過(guò)產(chǎn)生的具有生物活性的化合物，參與到海綿的生物防御系統(tǒng)中，其中一個(gè)重要的功能就是降解污染物［11］。因此，從海綿中分離具有降解功能的微生物，用于海洋環(huán)境的生物修復(fù)具有一定的意義。

本文從海綿中分離到一株的原油降解菌，命名為OA58，根據(jù)其生長(zhǎng)形態(tài)、培養(yǎng)特征、16S rRNA序列相似性比對(duì)分析和生化指標(biāo)檢測(cè)，對(duì)該菌株進(jìn)行了初步鑒定，并且研究了其對(duì)原油的降解能力。

1 材料與方法

1．1 培養(yǎng)基和溶液

菌株分離所需培養(yǎng)基和溶液包括：

人工海水培養(yǎng)基（ASM）：MgSO4·7H2O 7．0 g／L，KCl 0．7 g／L，KH2PO42．0 g／L，Na2HPO43．0 g／L，NH4NO31．0 g／L，NaCl 30 g／L，原油1 g／L，pH 7．2。每升培養(yǎng)基中加入微量元素液10 mL。液體培養(yǎng)基中加入18 g／L瓊脂，為固體平板分離培養(yǎng)基（ASM1）。

微量 元 素 溶 液：CaCl220 mg／L，F(xiàn)eCl350 mg／L，CuSO40．5 mg／L，MnCl2·4H2O 0．5 mg／L，ZnSO4·7H2O 10 mg／L。

固體平板純化培養(yǎng)基（2216E，Difco）：蛋白胨5．0 g／L，酵母提取物1．0 g／L，檸檬酸鐵0．1 g／L，NaCl 19．45 g／L，MgCl25．9 g／L，MgSO4·7H2O 3．24 g／L，CaCl21．8 g／L，KCl 0．55 g／L，NaHCO30．16 g／L，KBr 0．08 g／L，SrCl20．034 g／L，H3BO30．022 g／L，Na2SiO30．004 g／L，NaF 0．002 4 g／L，NH4NO30．001 6 g／L，Na2HPO40．008 g／L。

ISP?2培養(yǎng)基：酵母提取物4．0 g／L，麥芽提取物10．0 g／L，葡萄糖 4．0 g／L，瓊脂 15．0 g／L，pH 7．3。

1．2 菌株的分離篩選

菌株分離篩選方法參考文獻(xiàn)［12］進(jìn)行。自大連灣石油污染海域采集海綿樣品，用無(wú)菌海水清洗去除樣品表面雜質(zhì)，研磨至勻漿狀，加入人工海水培養(yǎng)基中，28℃、200 r／min培養(yǎng)7 d，反復(fù)轉(zhuǎn)接3次，以原油（濃度1 g／L）為唯一碳源和能源進(jìn)行富集。梯度稀釋涂布固體平板分離培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7～10 d，挑取單菌落于2216E純化培養(yǎng)劑劃線分離單菌，得到純培養(yǎng)。

1．3 菌株鑒定

對(duì)分離純化得到的菌株通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)、16S rRNA序列同源性比對(duì)分析，確定其分類地位。菌株的形態(tài)及生理生化特性測(cè)定參照文獻(xiàn)［13，14］進(jìn)行。將分離純化獲得的菌株OA58在ISP?2培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，按照參考文獻(xiàn)［15］方法提取菌株基因組DNA，進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增［12，16，17］，測(cè)序后進(jìn)行Blast比對(duì)，采用Clustalx1．81軟件構(gòu)建進(jìn)化樹［18］。

1．4 菌株降解特性

菌株OA58的降解特性及分析方法參考文獻(xiàn)［12］方法進(jìn)行。菌株OA58在人工海水培養(yǎng)基（含原油1 g／L）中30℃、200 r／min培養(yǎng)14 d，培養(yǎng)物用等體積的二氯甲烷和正已烷（V∶V＝1∶1）萃取，有機(jī)相為培養(yǎng)物中未降解原油，通過(guò)GC?FID、GC?MS對(duì)進(jìn)行分析定量，同時(shí)用重量法計(jì)算降解率。

2 結(jié)果與分析

2．1 菌株OA58的鑒定

2．1．1 形態(tài)培養(yǎng)特征 通過(guò)以原油（1 g／L）為唯一碳源和能源，篩選到一株細(xì)菌，命名為OA58。在光學(xué)顯微鏡下，菌株OA58基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲的形態(tài)如圖1（彩圖見封三圖版）所示。OA58孢子絲直或柔曲，孢子卵圓形至長(zhǎng)圓形，表面光滑。在ISP?2培養(yǎng)基上菌株OA58生長(zhǎng)豐茂，菌落呈白色，凸起，有褶皺，表面干燥且光滑?；鶅?nèi)菌絲無(wú)色或淺褐色，氣生菌絲黃白或灰白色，無(wú)可溶性色素。菌株OA58在多數(shù)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好，但在查氏培養(yǎng)基和高氏一號(hào)上長(zhǎng)勢(shì)較差（見表1）。在不同培養(yǎng)基上，基內(nèi)菌絲顏色乳白至乳黃色，氣生菌絲白色至黃白色。所有供試培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生可溶性色素。

圖1 菌株OA58的菌絲與分生孢子形態(tài)（×400）Fig．1 Mycelial and conidia of strain OA58（×400）．

表1 菌株OA58在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特征Table 1 Growth characteristics of strain OA58 on differentmedia．

2．1．2 生理生化鑒定 部分生理生化特征鑒定結(jié)果見表2。該菌不利用纖維素，水解淀粉能力強(qiáng)，明膠液化，不產(chǎn)H2S，不產(chǎn)酪氨酸酶，牛奶胨化并凝固，接觸酶陽(yáng)性。參考細(xì)菌分類鑒定手冊(cè)，結(jié)合菌株OA58在各種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)特征，可初步判定該菌為脫葉鏈霉菌（Streptomyces exfoliates）。

表2 菌株OA58生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain OA58．

2．1．3 分子鑒定結(jié)果 經(jīng)16S rRNA序列比對(duì)分析，與菌株OA58的16S rRNA基因序列相似度最高的菌株為Streptomyces exfoliatus RCS07，相似性達(dá)到99%。采用Clustal x1．81軟件，用N?J法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。菌株OA58與Streptomyces exfoliatus RCS07處于同一分枝，62%的自展值說(shuō)明了這一亞枝的穩(wěn)定性。結(jié)合菌株OA58的形態(tài)特征和部分理化指標(biāo)的分析，進(jìn)一步確定菌株OA58屬于脫葉鏈霉菌（Streptomyces exfoliatus）。

圖2 菌株OA58 16S rRNA基因序列進(jìn)化樹分析Fig．2 Phylogenetic tree of strain OA58 based on nearly full length 16S rRNA gene sequences．

圖3 菌株OA58降解前后原油中烷烴組分氣相色譜圖Fig．3 Gas chromatogram of the the alkane fraction in crude oil before or after biodegradation of strain OA58．

2．2 原油降解實(shí)驗(yàn)

對(duì)菌株OA58培養(yǎng)物中原油中烷烴組分的氣相色譜圖實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，菌株OA58能夠以原油為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。通過(guò)搖床培養(yǎng)14 d后，菌株OA58對(duì)石油中的不同長(zhǎng)度的烷烴組分都有一定程度的降解，對(duì)不同長(zhǎng)度的烷烴降解率不同，對(duì)中長(zhǎng)鏈烷烴（C17～C30）的降解率都達(dá)到50%以上（圖4）。采用重量法計(jì)算其降解率，該菌株對(duì)原油的降解率達(dá)83%。

圖4 菌株OA58對(duì)原油中各不同鏈長(zhǎng)烷烴的降解率Fig．4 Percentage of n?alkane degradation in crude oil by strain OA58．

3 討論

石油是一種復(fù)雜的混合物，主要是由烴類和非烴類組成，其中烴類占95%～99．5%［19］。

在石油污染海域我們發(fā)現(xiàn)，海綿和海鞘等海洋生物有較強(qiáng)的抗污和自潔能力，生長(zhǎng)狀態(tài)仍然良好。推測(cè)可能是海綿共生微生物參與海綿對(duì)石油污染的防御反應(yīng)，其中最大的可能是石油污染引起海綿共生微生物群落多樣性的變化，使得石油降解菌迅速增加，成為優(yōu)勢(shì)菌群，以加強(qiáng)海綿的生物修復(fù)功能，適應(yīng)環(huán)境的突變。因此，從海綿中篩選出具有高效石油降解能力的微生物，探索該類海綿共生微生物對(duì)環(huán)境的修復(fù)作用，可以為海洋石油污染的生物修復(fù)提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

本文以原油污染海域生長(zhǎng)的海綿為分離樣品，分離篩選到一株原油降解菌，命名為OA58，根據(jù)其生長(zhǎng)的形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化檢測(cè)結(jié)果和16S rRNA基因序列分析，初步鑒定為脫葉鏈霉菌（Streptomyces exfoliatus）。對(duì)其降解功能進(jìn)行了初步的研究，結(jié)果表明，菌株OA58對(duì)原油的降解率是83%，其對(duì)原油組分的中長(zhǎng)鏈烷烴有明顯降解優(yōu)勢(shì)。到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)脫葉鏈霉菌（Streptomyces exfoliatus）降解石油的報(bào)道，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株OA58的石油烴降解能力，以及其海洋來(lái)源的特點(diǎn)，為該菌株在海洋溢油的生物修復(fù)中具備良好的應(yīng)用前景。

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Sreening of Crude Oil Degrading Bacteria and its Degradation Capability

WU Pei?chun1，WANG Hai?tao1，LIU Ya?nan1，XIN Yan?juan1，CAO Xu?peng1，XUE Song1?
Marine Bioproducts Engineering Group，Dalian Institute ofChemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Liaoning Dalian 116023，China

A strain of crude oil degrading bacteria OA58 was isolated from a crude oil contaminated marine sponge from Dalian Bay，China．According to the 16S rRNA genes sequences analysis，physiological and biochemical characterizations，the strain OA58 was identified as Streptomyces exfoliatus．When the initial concentration of crude oil was 1 g／L，the strain OA58 could consume 83%of the crude oil in 14 days，indicating a good potential of degradation capability of crude oil．

crude oil；marine sponge；identification；biodegradation

10．3969／j．issn．2095?2341．2014．01．09

2013?10?18；接受日期：2013?11?26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31100092）；受格平綠色助學(xué)行動(dòng)遼寧環(huán)境科研‘123工程’（CEPF2010?123?2?20）資助。

吳佩春，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸?。E?mail：peichunwu＠dicp．a(chǎn)c．cn。?通信作者：薛 松，研究員，主要從事生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究。Tel：0411?84379069；E?mail：xuesong＠dicp．a(chǎn)c．cn