李傳鵬，李會，吳燕，李恒，張汝金，張崢斌，史勁松，許正宏

1江南大學藥學院，江蘇無錫214122

2浙江仙居君業(yè)藥業(yè)有限公司，浙江臺州317300

復合誘變選育高效轉化DHEA為7α,15α-diOH-DHEA的菌株及其轉化工藝優(yōu)化

李傳鵬1，李會1，吳燕1，李恒1，張汝金2，張崢斌2，史勁松1，許正宏1

1江南大學藥學院，江蘇無錫214122

2浙江仙居君業(yè)藥業(yè)有限公司，浙江臺州317300

李傳鵬,李會,吳燕,等.復合誘變選育高效轉化DHEA為7α,15α-diOH-DHEA的菌株及其轉化工藝優(yōu)化.生物工程學報,2014,30(1):147?156.

Li CP,Li H,Wu Y,et al.Optimization of hydroxylating DHEA to 7α,15α-diOH-DHEA by compound mutation and fermentation optimization.Chin J Biotech,2014,30(1):147?156.

結合酮康唑抗性篩選法，采用亞硝基胍和低能氮離子注入復合誘變方法篩選得到一株高效生物轉化去氫表雄酮(DHEA)為3β,7α,15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮(7α,15α-diOH-DHEA)的菌株亞麻刺盤孢Colletotrichum lini ST-1，該突變株在底物DHEA投料濃度為10 g/L時產物摩爾得率達到34.2%，較出發(fā)菌株提高了46.2%。在此基礎上進行培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，采用Plackett-Burman實驗設計考察轉化培養(yǎng)基中各組分對產物摩爾得率的影響，有效篩選出葡萄糖、酵母粉和MgSO4·7H2O濃度對產物摩爾得率影響顯著，繼而采用最陡爬坡路徑逼近最大響應區(qū)域，并利用中心組合響應面設計實驗對3個顯著性因素的最佳水平進行研究，得到最適轉化培養(yǎng)基組分為(g/L)：葡萄糖26.34；酵母粉12.15；玉米漿3.00；FeSO4·7H2O 0.015；MgSO4·7H2O 0.14；KH2PO40.90。采用該優(yōu)化培養(yǎng)基，菌株C.lini ST-1的產物摩爾得率達到49.3%，較優(yōu)化前提高了44.2%。

亞麻刺盤孢，生物轉化，復合誘變，培養(yǎng)基優(yōu)化，響應面法

甾體激素藥物對機體有重要的調節(jié)作用，廣泛應用于醫(yī)藥行業(yè)，其市場價值僅次于抗生素，在生物技術的推動下，其生產已經成為醫(yī)療保健行業(yè)的重要分支[1-4]。去氫表雄酮(DHEA)是自然界生物體內重要的活性物質，其雙羥化產物3β,7α,15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮(7α,15α-diOHDHEA)是第4代口服避孕藥有效成分屈螺酮的重要前體[5-6]。

生物轉化是一種有效的工具，與化學合成相比，反應條件溫和、具有較強的區(qū)域和立體選擇性，可以完成一些化學方法難以合成化合物的制備，并且已廣泛應用于甾體化合物的合成[7-9]。近年來生物轉化DHEA的研究越來越受到關注，尚珂等[10]采用亞麻刺盤孢Colletotrichum lini AS 3.4486對DHEA進行生物轉化，并且對其羥化機理進行了初步探究。Romano等[11]應用C.lini在N,N-二甲基甲酰胺助溶、添加輔底物葡萄糖和Tween-80分散條件下對DHEA進行批次轉化，在DHEA總投料濃度為7 g/L時能得到5.8 g/L的7α,15α-diOH-DHEA。Lobastova等[12]分別采用尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum VKM F-1600和赤霉菌Gibberella zeae BKM F-2600轉化DHEA，在投料濃度為2 g/L時產物摩爾得率分別達到63.0%和68.0%。但是仍然存在菌株轉化效率不高、底物投料濃度低等缺點，成為DHEA生物轉化工業(yè)化應用的瓶頸[13]。因此，通過篩選或改良獲得一株高效轉化DHEA的菌株具有重要的意義。

發(fā)酵過程參數的優(yōu)化通常采用單因素實驗，但是操作周期長，無法考察各因素之間的相互關系。Plackett-Burman實驗設計是一種兩水平、基于不完全平衡塊原理的設計方法，可以用最少的實驗次數在眾多的影響因素中快速有效地篩選出關鍵因素[14]。響應面法是利用合理的實驗設計，通過模型的構建與擬合，對各因素及各因素之間的相互作用進行優(yōu)化和評價，快速有效地尋求最優(yōu)工藝參數的一種統(tǒng)計方法[15]。近年來，利用響應面設計對發(fā)酵過程參數的優(yōu)化得到廣泛的應用[16-21]。

本研究以實驗室保藏的C.lini為出發(fā)菌株，通過亞硝基胍(NTG)和低能氮離子(N+)注入復合誘變，并結合酮康唑抗性篩選法獲得一株高效轉化DHEA為7α,15α-diOH-DHEA的菌株。并在此基礎上采用統(tǒng)計學設計方法對轉化培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，以進一步提高誘變菌株的轉化效率，為DHEA生物轉化的工業(yè)化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

C.lini：由本實驗室保藏。

1.2 主要材料與試劑

DHEA、7α,15α-diOH-DHEA為國產分析純，由浙江仙居君業(yè)有限公司提供；7α-OH-DHEA由本實驗室制備；其他化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司；TLC薄板購自青島海洋化工有限公司。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。30℃培養(yǎng)3–5 d。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15，酵母粉15，玉米漿3，豆餅粉10，pH自然。取菌種斜面，無菌水洗下孢子，玻璃珠振蕩打散，調整孢子濃度為1×106個/mL，取3 mL接種于含有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)3 d后以10%(V/V)的接種量轉接于種子培養(yǎng)基二次活化，30℃、220 r/min培養(yǎng)1 d后制得液體種子。

酮康唑篩選培養(yǎng)基(g/L)：PDA液體培養(yǎng)基冷卻至70℃左右，加入不同體積的酮康唑母液(DMSO溶解、0.22 μm有機系濾膜過濾除菌)，混合均勻倒平板。

轉化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15，酵母膏15，玉米漿3，FeSO4·7H2O 0.02，MgSO4·7H2O 0.3，KH2PO41，pH 6.5。以10%(V/V)的接種量接種于含有30 mL轉化培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)至24 h，以10 g/L投入底物DHEA，轉化3 d后停止轉化。

1.4 主要儀器

HYL-C組合式搖床購自太倉強樂實驗設備有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀購自戴安公司；離子束注入設備由南京工業(yè)大學提供。

1.5 分析方法

1.5.1 薄層層析(TLC)檢測法

展開劑(氯仿:甲醇=15:1(V/V))；顯色劑(濃硫酸:乙醇=1:1(V/V))。采用硅膠板，點樣量3 μL，105℃加熱5 min顯色。

1.5.2 高效液相色譜(HPLC)檢測法

取轉化液，乙酸乙酯抽提多次后合并抽提液，干燥至出現結晶；色譜純乙腈復溶，0.22 μm的有機膜過濾除雜，HPLC檢測。

HPLC條件：柱型，Agilent TC-C18，4.6 mm× 250 mm，5 μm；流動相，乙腈/水(70∶30)；柱溫30℃；檢測波長，206 nm；流速，0.5 mL/min；進樣量，10μL。

1.6 復合誘變方法

1.6.1 酮康唑最低抑菌濃度的確定

將單孢子懸液稀釋涂布于含有不同濃度酮康唑的PDA平板，30℃培養(yǎng)1–2 d后平板菌落計數，未生長菌落的最低作用濃度即為酮康唑的最低抑菌濃度[22]。

1.6.2 亞硝基胍(NTG)誘變劑量的確定

將單孢子懸液(1×106–1×108個/mL)與1 mg/mL的NTG溶液等體積混合，吹打均勻、30℃搖床振蕩反應，分別處理10–60 min，0.9 mol/L的生理鹽水稀釋終止反應，稀釋涂布于PDA平板；對照組未加入亞硝基胍；30℃培養(yǎng)1–2 d后平板菌落計數，選擇致死率在80%–90%的劑量作為最佳誘變劑量。

1.6.3 低能氮離子(N+)注入誘變劑量的確定

吸取100 μL單孢子懸液(1×106–1×108個/mL)均勻涂布于無菌空白平皿，無菌風吹干制成菌膜，放入無菌真空靶室內進行N+離子注入(注入能量15 000 eV，注入劑量0.4×1016–4.0×1016ions/cm2，脈沖式注入，每個脈沖5 s，間隔15 s)，注入結束后加入1 mL無菌水洗下，稀釋涂布于PDA平板；對照組置于真空靶室內，不經離子注入；30℃培養(yǎng)1–2 d后平板菌落計數，計算存活率；分別挑取不同注入劑量平板上單菌落搖瓶發(fā)酵，計算正突變率，選擇正突變率最大的劑量為最佳注入劑量[23]。

1.6.4 復合誘變

將出發(fā)菌株單孢子懸液(1×109–1×1010個/mL)以亞硝基胍最佳誘變劑量處理后，吸取100 μL單孢子懸液制成菌膜，然后以最佳注入劑量氮離子注入，誘變結束后稀釋涂布于含有最低抑菌濃度的酮康唑篩選平板，篩選獲得高產突變株。

1.6.5 菌株的篩選

初篩：從生長差異較大篩選平板上隨機挑取生長良好的酮康唑抗性突變株劃線PDA平板，培養(yǎng)3–5 d后挑取氣生菌絲劃線PDA斜面。

復篩：單孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，將二次活化種子液以10%(V/V)的接種量接種轉化培養(yǎng)基，培養(yǎng)至24 h以10 g/L投入底物DHEA，轉化3 d后停止轉化，取樣萃取和HPLC檢測。

1.7 優(yōu)化設計

Plackett-Burman設計：在單因素實驗的基礎上，通過Plackett-Burman設計對影響產物摩爾得率的轉化培養(yǎng)基各組分進行篩選，找出關鍵因素。

最陡爬坡實驗：根據Plackett-Burman實驗篩出的重要因素效應的正負和大小來設計步長，按照正效應取較高值、負效應取較低值的原則，進一步逼近產物摩爾得率最大響應區(qū)域。

中心組合設計實驗：根據Plackett-Burman實驗篩選出的重要因素和最陡爬坡實驗確定的響應面實驗因素水平的中心點，利用Design expert V8.0.6軟件設計響應面實驗，對實驗結果進行回歸模型的方差分析和響應面分析，用F檢驗評價數學模型方程的顯著性，方程的擬合性由決定系數R2確定，最后獲得最佳培養(yǎng)基配方。

1.8 模型驗證

對擬合得到的回歸方程的各自變量求偏導數得到方程組，求解方程組得到極值點的自變量取值。再按照計算得到的參數進行3次發(fā)酵轉化驗證實驗，以驗證模型的可靠性，并確定最終的優(yōu)化結果。

2 結果與分析

2.1 復合誘變篩選結果

2.1.1 酮康唑最低抑菌濃度的確定

P450酶為甾體羥化反應中起催化作用的酶，酮康唑等唑類化合物可以抑制P450酶活性，菌株的酮康唑抗性與P450酶羥化活力具有一定的相關性[24]。表1為不同酮康唑濃度下菌株的生長狀況，由表可知酮康唑濃度達到100 μmol/L時沒有菌落生長，將其作為最低抑菌濃度。

表1 酮康唑最低抑菌濃度的確定Table 1Minimum inhibitory concentration of ketoconazole

2.1.2 亞硝基胍誘變劑量的選擇

圖1為亞硝基胍誘變致死率曲線。對于多核細胞或孢子采用較高的誘變劑量可以獲得較純的變異菌落[25]，因此選擇致死率在80%–90%的作用時間30 min作為最佳誘變劑量。

2.1.3 低能氮離子注入誘變劑量的選擇

圖2為N+離子注入(注入能量15 000 eV，注入劑量0–4.0×1016ions/cm2)“馬鞍形”存活率曲線。圖3為N+離子注入劑量與正突變率的關系圖，由圖可知隨著注入劑量的增大，正突變率先增大后減小，注入劑量為2.8×1016ions/cm2時正突變率最大，將其作為最佳注入劑量。

2.1.4 復合誘變菌株的篩選

以最佳誘變劑量進行復合誘變。經多輪篩選選取5株產量較高的菌株斜面保藏并進行搖瓶復篩，最終選取菌株C.lini ST-1進行后續(xù)研究。其產物摩爾得率達到34.2%，與出發(fā)菌株(產物摩爾得率23.4%)相比提高了46.2%。突變株經斜面連續(xù)傳代5次后，產物摩爾得率穩(wěn)定，表明菌株遺傳穩(wěn)定性良好。傳代穩(wěn)定性實驗結果見表2。

圖1 NTG誘變致死率曲線Fig.1Lethality curve by NTG.

圖2 N+注入存活率曲線Fig.2Survival rate curve by N+implantation.

圖3 N+注入劑量與正突變率的關系Fig.3Relation of dose and positive mutation rate of N+implantation.

2.2 統(tǒng)計學實驗優(yōu)化轉化培養(yǎng)基

2.2.1 Plackett-Burman實驗

利用design expert V8.0.6軟件進行PB實驗設計，對葡萄糖(X1)、酵母粉(X2)、玉米漿(X3)、FeSO4·7H2O(X4)、MgSO4·7H2O(X5)、KH2PO4(X6) 6個因素進行考察，每個因素取高(+)低(-)兩個水平，響應值為7α,15α-diOH-DHEA的摩爾得率(Yp)。實驗設計與結果見表3，實驗結果方差分析見表4。

表4顯示葡萄糖、酵母粉和MgSO4·7H2O對產物摩爾得率影響顯著(P＜0.05)。其中正向影響因子為葡萄糖，負向影響因子為酵母膏和MgSO4·7H2O，各因素對產物摩爾得率的影響可用以下方程表示：

方程的決定系數R2=0.9530，表明該回歸方程擬合良好。

2.2.2 最陡爬坡實驗結果

試驗設計及結果如表5所示。由表5可知最大產物摩爾得率區(qū)在第4次實驗附近，產物得率達到47.1%。因此，后續(xù)響應面實驗將實驗4的培養(yǎng)基濃度作為中心組合設計實驗的中心點。

表2 突變株的遺傳穩(wěn)定性Table 2Genetic stability of mutant strain

表3 Plackett-Burman實驗設計及響應值Table 3Plackett-Burman design and responding value

表4 Plackett-Burman實驗設計各因素水平及影響效果Table 4Factors levels and results of Plackett-Burman design

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5Experimental design and results of steepest ascent

2.2.3 響應面實驗結果分析

采用design expert V8.0.6軟件進行響應面試驗設計確定顯著因子的最優(yōu)水平，并進行回歸分析和方差分析，擬合得到回歸方程:

中心組合試驗設計及結果見表6，回歸模型的方差分析見表7，響應面圖形見圖4–6。

從表7的回歸模型的方差分析以看出，回歸模型的P＜0.0001，該值小于0.01，表明該模型極顯著。一次項X2、X5的P＜0.05，顯著，平方項X12、X22、X52的P＜0.0001，極顯著，表明各因素與產物摩爾得率之間存在明顯的二次關系，X1X5、X2X5的P＜0.05，顯著，且X2X5達到極顯著水平，表明X2與X5的交互作用對產物摩爾得率影響顯著。一次項X1和交互項X1X2的P>0.05，不顯著。失擬項的P值為0.2304，遠遠大于0.05，不顯著，表明實驗數據與模型擬合良好。模型的復相關系數R2=0.9638，表明該模型能夠解釋96.38%的響應值變化，該模型能較好地模擬7α,15α-diOH-DHEA的實際轉化過程。

表6 中心組合設計及結果Table 6Experiment design and results of the CCD design

表7 回歸模型方差分析Table 7ANOVA of response surface model

從圖4–6響應面分析立體圖可以看出X1與X5、X2與X5的交互作用顯著，X1、X2和X5存在極值點。對回歸方程求導得到培養(yǎng)基組分(g/L)為：葡萄糖26.34；酵母粉12.15；玉米漿3；FeSO4·7H2O 0.015；MgSO4·7H2O 0.14；KH2PO40.9。將各數值代入回歸方程得到理論產物摩爾得率預測值為48.6%。為檢驗模型預測的準確性，在優(yōu)化條件下進行轉化實驗，產物摩爾得率平均值為49.3%，與模型預測值非常接近，表明該模型能夠很好地預測實際的轉化情況。

圖4 葡萄糖和酵母粉濃度對產物摩爾得率影響的響應面圖Fig.4Surface layer of the mutual-affection of glucose and yeast extract concentration on molar yield of product.

圖5 葡萄糖和MgSO4·7H2O濃度對產物摩爾得率影響的響應面圖Fig.5Surface layer of the mutual-affection of glucose and MgSO4·7H2O concentration on molar yield of product.

圖6 酵母粉和MgSO4·7H2O濃度對產物摩爾得率影響的響應面圖Fig.6Surface layer of the mutual-affection of yeast extract and MgSO4·7H2O concentration on molar yield of product.

3 結論

本實驗對C.lini進行復合誘變，篩選獲得一株7α,15α-diOH-DHEA高產菌株C.lini ST-1，該突變株在DHEA投料濃度10 g/L條件下，產物摩爾得率達到34.2%，與出發(fā)菌株相比提高了46.2%。為進一步提高菌株的轉化能力，采用統(tǒng)計學實驗設計對轉化培養(yǎng)基進行優(yōu)化，利用中心組合設計實驗對Plackett-Burman實驗篩選出的3個關鍵因素進行研究，確定最佳轉化培養(yǎng)基配方為葡萄糖26.34 g/L、酵母粉12.15 g/L、MgSO4·7H2O 0.14 g/L，產物摩爾得率理論預測值為48.6%。在最優(yōu)培養(yǎng)基條件下，產物摩爾得率為49.3%，與理論預測值非常接近，較優(yōu)化前提高了44.2%，說明采用響應面法優(yōu)化亞麻刺盤孢轉化培養(yǎng)基是可行的。

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(本文責編郝麗芳)

July 23,2013;Accepted:October 21,2013

Hui Li.Tel:+86-510-85326883;Fax:+86-510-85918206;E-mail:lihui@jiangnan.edu.cn

Optimization of hydroxylating DHEA to 7α,15α-diOH-DHEA by compound mutation and fermentation optimization

Chuanpeng Li1,Hui Li1,Yan Wu1,Heng Li1,Rujin Zhang2,Zhengbin Zhang2,Jinsong Shi1, and Zhenghong Xu1
1 School of Pharmaceutical Science,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China
2 Zhejiang Xianju Junye Pharmaceutical Co.,Ltd.,Taizhou 317300,Zhejiang,China

Combined with method of ketoconazole resistance screening,a 7α,15α-diOH-DHEA high-producing mutant Colletotrichum lini ST-1 was obtained by compound mutation of NTG and low energy N+ion beam implantation.With the substrate concentration of 10 g/L DHEA,the molar yield of 7α,15α-diOH-DHEA reached 34.2%,increased by 46.2%than that of the original strain.Then we optimized the medium.First,Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of medium components on molar yield of the product.Results show that glucose,yeast extract and MgSO4·7H2O were the important parameters for the biotransformation process.Subsequently,the path of steepest ascent was used to approach the optimal levels.To obtain the optimal levels,central composite design and response surface analysis were carried out.The optimal medium was as follows(g/L):glucose 26.34,yeast extract 12.15,corn flour 3.00,FeSO4·7H2O 0.015, MgSO4·7H2O 0.14,KH2PO40.90.Under the optimal conditions,the molar yield of 7α,15α-diOH-DHEA reached 49.3%, which was 44.2%higher than that of using the medium before optimization.

Colletotrichum lini,biotransformation,compound mutation,medium optimization,response surfaces methodology

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2011AA02A211),National Natural Science Foundation of China(No.21206055),Natural Science Foundation of Jiangsu Province,China(No.BK2012127).