湯琳

(上海市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，上海 200030)

糞大腸菌群，一群能在44.5±0.5℃溫度下生長(zhǎng)，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，國(guó)外又稱耐熱大腸菌群。主要來(lái)源于人畜糞便，可導(dǎo)致腸道傳染病傳播，如傷寒、霍亂、細(xì)菌性痢疾、脊髓灰質(zhì)炎和傳染性肝炎等，是水質(zhì)污染的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一［1－2］。因此，不斷優(yōu)化糞大腸桿菌的檢測(cè)方法具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。酶底物法作為一種新興的糞大腸菌群檢測(cè)方法，具有準(zhǔn)確、快速、可靠的檢測(cè)特點(diǎn)，對(duì)及時(shí)反映監(jiān)測(cè)水域糞便污染狀況，有效預(yù)報(bào)和控制流行疾病的發(fā)生與傳播具有重要意義。

1 研究背景

水體微生物污染狀況日趨嚴(yán)重，作為水體污染重要組成內(nèi)容，微生物污染集中體現(xiàn)在糞便污染，糞便是病原微生物、病毒、原生動(dòng)物和蠕蟲的主要來(lái)源，可導(dǎo)致人類腸道傳染病傳播(WHO的飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則)。1992年，生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)修訂會(huì)議上首次提出將糞大腸菌群作為糞便污染的重要衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，與菌落總數(shù)、總大腸菌群和大腸埃希氏菌共同作為糞便污染的微生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

然而，實(shí)際工作中，尤其是在應(yīng)急監(jiān)測(cè)中，監(jiān)測(cè)部門無(wú)法對(duì)水體中各種致病微生物進(jìn)行檢測(cè)。故絕大多數(shù)時(shí)候，通過糞大腸菌群的檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)水體污染情況，從而反映對(duì)人體健康的危害大小。正是糞大腸菌群在監(jiān)測(cè)中的代表性，使其在國(guó)內(nèi)各類標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用廣泛。不同標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用情況和限值具體見表1。

由表可見，從檢測(cè)意義上來(lái)說(shuō)，推廣快速、簡(jiǎn)便的糞大腸菌群酶底物檢測(cè)法對(duì)不同行業(yè)的水質(zhì)監(jiān)測(cè)具有重要意義。

2 酶底物法解析

表1 各類質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的糞大腸菌群限值

2.1 酶底物法介紹

酶底物法［7］，利用糞大腸菌群在 44.5℃生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的β－半乳糖苷酶和β－葡萄糖醛酸酶，分解培養(yǎng)液中的鄰硝基苯－β－D－吡喃半乳糖苷(ONPG)和β－葡萄糖醛酸，使培養(yǎng)液呈現(xiàn)黃色和熒光反應(yīng)(陽(yáng)性)這一原理進(jìn)行檢測(cè)，最后根據(jù)陽(yáng)性的組合，查MPN表得出數(shù)量。

實(shí)際操作中，首先需要根據(jù)水樣的污染程度對(duì)待測(cè)水樣作適當(dāng)稀釋，然后用無(wú)菌瓶取混勻水樣100 mL，加入 Colilert(科立得)試劑1份，溶解混勻，倒入97孔定量盤，封口，于44.5±0.2℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，最后根據(jù)陽(yáng)性孔數(shù)，查MPN表并計(jì)算。

酶底物法在美國(guó)最早得到推廣和應(yīng)用，用酶底物法檢測(cè)糞大腸菌群、總大腸菌群和大腸埃希氏菌已獲得美國(guó)EPA認(rèn)證，在美國(guó)、歐洲、日本等地得到廣泛的應(yīng)用。在中國(guó)，2006年頒布的《生活飲用水國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 5750.12－2006)中將酶底物法列為總大腸菌群的國(guó)標(biāo)方法，但尚未作為糞大腸菌群監(jiān)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。

2.2 酶底物法與其他方法比較

國(guó)內(nèi)檢測(cè)糞大腸菌群一直沿用國(guó)外早期的實(shí)驗(yàn)方法，以MPN法和濾膜法傳統(tǒng)方法為主［4］。隨著生物監(jiān)測(cè)技術(shù)發(fā)展，紙片法、固定酶底物法、分子生物學(xué)鑒定法等方法相繼出現(xiàn)并得到了一定范圍的應(yīng)用。各檢測(cè)方法比較見表2。

表2 糞大腸菌群各檢測(cè)方法比較

從實(shí)驗(yàn)操作上，酶底物法取樣加藥后封口培養(yǎng)，過程簡(jiǎn)單，較少受人為污染，雖然紙片法操作也較簡(jiǎn)便，但操作過程易受污染，且需要確證試驗(yàn);從結(jié)果反映上，酶底物法97孔定量盤的最大可能數(shù)表卻有2 352組，比其他方法的最大可能數(shù)表(多管發(fā)酵法56組)查表時(shí)更為準(zhǔn)確。此外，酶底物法應(yīng)用酶技術(shù)進(jìn)行糞大腸菌群檢測(cè)，出現(xiàn)假陰性、假陽(yáng)性現(xiàn)象較少;綜上可見，酶底物法相對(duì)于其他檢測(cè)方法更為準(zhǔn)確。

3 酶底物法的應(yīng)用和研究狀況

3.1 酶底物法的應(yīng)用

糞大腸菌群作為衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，在不同行業(yè)都有監(jiān)控要求，酶底物法作為糞大腸菌群的新興檢測(cè)方法，在標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用見表3。

表3 檢測(cè)糞大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)方法調(diào)研

由表3可見，目前國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)糞大腸菌群的檢測(cè)以多管發(fā)酵法為主，沒有酶底物法的規(guī)定應(yīng)用。由此可見，不斷強(qiáng)化酶底物法檢測(cè)糞大腸菌群的檢測(cè)，推廣酶底物法的應(yīng)用，可以填補(bǔ)國(guó)家在糞大腸菌群快速檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)上的空白，也為滿足當(dāng)前和今后一定時(shí)期內(nèi)國(guó)家環(huán)境保護(hù)工作的需要做好鋪墊。

3.2 酶底物法的研究現(xiàn)狀

酶底物法在美國(guó)最早得到推廣和應(yīng)用，用酶底物法檢測(cè)糞大腸菌群已獲得美國(guó)EPA認(rèn)證，在美國(guó)、歐洲、日本等地得到廣泛的應(yīng)用。雖然該法并未成為中國(guó)檢測(cè)糞大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)方法，但并未阻止許多學(xué)者對(duì)其的研究。高瑞坤等［14］比較了固定底物酶底物法與多管發(fā)酵法來(lái)檢測(cè)水中糞大腸菌群，結(jié)果表明，兩種方法用于水中糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果具有一致性;崔松陽(yáng)等［15］結(jié)合3家單位數(shù)據(jù)對(duì)比，說(shuō)明了DST－酶底物法和多管發(fā)酵法檢測(cè)糞大腸菌群的一致性;遇曉杰等［4］認(rèn)為固定底物酶底物法與傳統(tǒng)多管發(fā)酵法沒有區(qū)別;段玉林等［16］用酶底物法對(duì)地表水水樣進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋后進(jìn)行培養(yǎng)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)確掌握水樣稀釋倍數(shù)對(duì)測(cè)定結(jié)果就越準(zhǔn)確。此外，在四川5.12抗震救災(zāi)［8］中，酶底物法被用來(lái)檢測(cè)生活飲用水中的耐熱大腸菌群，成功保障了廣大災(zāi)區(qū)人民群眾生活飲用水的供水安全，在應(yīng)急監(jiān)測(cè)中發(fā)揮了重要的作用。

所有以上相關(guān)研究表明，酶底物法可以作為評(píng)價(jià)水質(zhì)微生物污染的快速標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。

3.3 酶底物法應(yīng)用前景

酶底物法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果快速準(zhǔn)確，在環(huán)境監(jiān)測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用前景，主要表現(xiàn)為以下幾點(diǎn)：(1)糞大腸菌群作為環(huán)境衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，具有實(shí)際監(jiān)測(cè)意義，故酶底物法作為糞大腸菌群的快速檢測(cè)方法，滿足應(yīng)用需求;(2)傳統(tǒng)糞大腸菌群監(jiān)測(cè)方法操作繁瑣，需要48～72 h才能獲取結(jié)果，需要專業(yè)人員和專業(yè)檢測(cè)條件，水樣保存時(shí)間苛刻，在中西部地區(qū)執(zhí)行率不高，分子技術(shù)儀器要求高，且需要專業(yè)人員操作，明顯不適用環(huán)境污染事故監(jiān)測(cè)的要求;(3)酶底物法測(cè)定水樣中的糞大腸菌群具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，無(wú)需清洗玻璃器皿，無(wú)需無(wú)菌室，無(wú)需配置培養(yǎng)基，24 h內(nèi)定量檢測(cè)，極大地減少了工作量，同時(shí)可以避免使用多管法時(shí)逐級(jí)稀釋帶來(lái)的操作誤差，也避免了使用濾膜法時(shí)肉眼讀數(shù)的人為誤差，能夠較為準(zhǔn)確地判斷水樣的污染狀況;(4)現(xiàn)有糞大腸菌群監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中未有酶底物法的規(guī)定，而酶底物法已經(jīng)被世界各國(guó)及地方實(shí)驗(yàn)室和世界各組織機(jī)構(gòu)認(rèn)可［17］，中國(guó)急需將檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)際接軌，探索和完善適用本國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)的糞大腸菌群酶底物法。

4 總結(jié)

酶底物法根據(jù)糞大腸菌群的特異性酶，與特異性底物反應(yīng)，通過顏色變化和熒光作為檢測(cè)結(jié)果的判斷依據(jù)，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀、清晰、可靠，客觀性強(qiáng)，缺點(diǎn)是使用的培養(yǎng)基只有國(guó)外生產(chǎn)商供應(yīng)，檢測(cè)成本較高。相信今后在科學(xué)研究上的不斷強(qiáng)化，使酶底物法的培養(yǎng)基逐漸實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化，從而降低使用成本，使其具有更廣闊的應(yīng)用范圍和前景，作為評(píng)價(jià)水質(zhì)微生物污染的快速標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法在日常監(jiān)測(cè)和應(yīng)急監(jiān)測(cè)中發(fā)揮重要作用。

［1］國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法［M］.4版.北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2002：701－706.

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