肖躍強(qiáng)，劉吉山，楊 慧，沈志強(qiáng),，丁 壯

（1. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長春130062；2. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600；3.山東綠都生物科技有限公司，濱州 256600）

兔出血癥（rabbit haemorrhagic disease, RHD）是一種嚴(yán)重威脅兔產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展及野生兔群生態(tài)平衡的烈性傳染病，其典型特征為發(fā)病快且病死率高，高達(dá)40%～90%[1]。該病首先在中國暴發(fā)，并迅速流行至其他亞洲周邊與歐美國家，墨西哥、韓國等國由于和我國存在相關(guān)產(chǎn)業(yè)貿(mào)易導(dǎo)致該病的發(fā)生流行[2,3]。由于國際貿(mào)易日益增多與臨床防控難度加重，開展該病的早期快速診斷至關(guān)重要。

兔出血癥病原兔出血癥病毒（Rabbit haemorrhagic disease virus, RHDV）是單股正鏈RNA病毒，雖然還不能對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)，但國內(nèi)外學(xué)者在病原學(xué)、免疫學(xué)、臨床診斷與防治等方面已開展了深入研究。診斷是防控該病的根本，目前世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）官方推薦的實(shí)驗(yàn)室診斷法方法包括血凝（hemagglutinin，HA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、Western blot、免疫染色、電鏡負(fù)染觀察、動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)等。同樣，血凝抑制（hemoagglutination inhibition，HI）、免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（immune agar diffusion test，ID）[4]、對(duì)流免疫電泳[5]、SPA菌體免疫掃描電鏡法[6]、免疫電鏡捕獲雙裝飾法[7]、TaqMan探針或SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法[8-10]等也被廣泛應(yīng)用。但是，這些方法均存在一定的缺陷，有些需要繁瑣的樣品處理過程，耗時(shí)費(fèi)力，如SPA菌體免疫掃描電鏡法、免疫電鏡捕獲雙裝飾法等；有些簡單實(shí)用但敏感性不高，如HA、HI、ID等；有些雖然特異性強(qiáng)、敏感性高，但成本較高，如TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量方法等。因此，本研究通過設(shè)計(jì)篩選引物組合，建立了一種快速、敏感、特異的RHDV RT-PCR分子生物學(xué)檢測(cè)方法，并開展了臨床應(yīng)用，為RHDV的早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查等提供一種有效的技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 2×Power Taq PCR Master Mix、rTaq DNA聚合酶、2.5 mmol/L dNTP、RNA酶抑制劑、rTaq DNA聚合酶、MgCl2（25 mmol/L）等購自TaKaRa公司；TRIzol試劑購自上海生工；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶等購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 病毒株 兔出血癥病毒（RHDV）、兔輪狀病毒（Rabbit Rotavirus，RRV）、兔水泡性口炎病毒（Rabbit Vesicular stomatitis virus，RVSV）均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 應(yīng)用Primer Premier 5.0生物軟件，根據(jù)GenBank中公布的RHDV全基因組序列，設(shè)計(jì)了上游引物F與下游引物R1、R2。F：5'-ACCCATCATGTTCGCGTCTG-3'，R1：5'-TCCTGCATAAAARTACCCGTCC-3'，R2：5'-CAGGTTGAACACGAGTGTGCT-3'，引物組合理論上可分別擴(kuò)增出235 bp與331 bp目的基因，引物合成與純化委托上海生工完成。

1.4 病毒cDNA合成 使用TRIzol試劑提取病毒基因組RNA，具體操作按說明書進(jìn)行，干燥后加入DEPC水溶解提取的RNA，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，具體操作按說明書進(jìn)行。

1.5 下游引物的篩選 PCR體系為：2×Power Taq PCR Master Mix 5 μL、引物組合F+R1/R2各 0.5 μL、并加入對(duì)應(yīng)的cDNA 1 μL、滅菌ddH2O 10 μL，設(shè)空白對(duì)照。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，57.5℃退火40 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增，確定下游引物。

1.6 PCR擴(kuò)增優(yōu)化

1.6.1 PCR擴(kuò)增Mg2+濃度 以確定的上下游引物組合優(yōu)化離子濃度，反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液（Mg2+free）2.5 μL，MgC12（25 mmol/L）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶0.5 μL（5 U/μL），合成的cDNA 1 μL，補(bǔ)滅菌ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，57.5℃退火40 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增。

1.6.2 退火溫度優(yōu)化 確定Mg2+最佳工作濃度后，通過50℃～60℃溫度區(qū)間梯度PCR，繼續(xù)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序。

1.7 敏感性試驗(yàn) 由微量核酸測(cè)定儀測(cè)定回收PCR產(chǎn)物濃度，并根據(jù)拷貝數(shù)=（6.02×1023）×（ng/μL×10-9）/（DNA length×660）計(jì)算，等比稀釋模板拷貝數(shù)為106～101拷貝/5 μL，進(jìn)行PCR，評(píng)定敏感性。

1.8 特異性試驗(yàn) 利用TRIzol試劑提取兔輪狀病毒、兔水泡型口炎病毒基因組樣品，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，之后進(jìn)行PCR特異性檢測(cè)。

1.9 臨床應(yīng)用比較性試驗(yàn) 應(yīng)用本研究建立的RHDV RT-PCR檢測(cè)方法與血凝試驗(yàn)（HA）同時(shí)檢測(cè)臨床疑似RHDV感染的臨床組織病料27份，比較2種檢測(cè)方法的敏感性與特異性。對(duì)檢測(cè)結(jié)果不一致的臨床組織病料進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，每份樣品攻毒4只未免疫家兔，通過觀察攻毒兔的臨床癥狀與病理變化確定是否為RHDV感染所致，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照攻毒組。

2 結(jié)果與討論

2.1 下游引物篩選 不同引物擴(kuò)增組合擴(kuò)增結(jié)果電泳檢測(cè)見圖1?？梢?，F(xiàn)+R2引物組合可特異性的擴(kuò)增出大小為331 bp的單一目的基因，而F+R1組合雖然能擴(kuò)增出235 bp的目的片段，但存在非特異性擴(kuò)增，經(jīng)后期PCR條件優(yōu)化后也不能夠完全消除，因此，選取F+R2組合用于本實(shí)驗(yàn)RHDV檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用。經(jīng)Blast分析，所設(shè)計(jì)引物序列與目前已經(jīng)公布的所有病毒株序列對(duì)應(yīng)區(qū)域完全一致，利用該方法可以檢測(cè)所有的RHDV毒株。

圖1 不同引物組合PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results from different combination of primers

2.2 Mg2+濃度的優(yōu)化 在0.5～3.0 mmol/L區(qū)間Mg2+濃度擴(kuò)增結(jié)果見圖2。當(dāng)Mg2+濃度為0.5 mmol/L時(shí)，無任何產(chǎn)物與特異性擴(kuò)增；當(dāng)濃度在2.0 mmol/L及以上時(shí)，隨著濃度增高，特異性產(chǎn)物濃度越來越低，非特異性產(chǎn)物濃度越來越高；在濃度為1.0 mmol/L和1.5 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物特異單一，而且也無引物二聚體。可見，當(dāng)Mg2+濃度為1.0～1.5 mmol/L，均能獲得高效特異的擴(kuò)增，因此選擇1.5 mmol/L Mg2+濃度進(jìn)行其他反應(yīng)條件的優(yōu)化。

圖2 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Fig.2 PCR results at different concentration of Mg2+

2.3 溫度梯度PCR 在Mg2+濃度為1.5 mmol/L條件下，退火溫度為50℃～60℃，均可高效擴(kuò)增目的DNA片段，無非特異性擴(kuò)增、無引物二聚體，且不同退火溫度的擴(kuò)增效率無明顯差異。證明在此溫度區(qū)間內(nèi)，目的片段可以得到很好的擴(kuò)增，而且無差異性，電泳結(jié)果見圖3。該方法具有良好的退火溫度區(qū)間，引物特異性強(qiáng)。同時(shí)，由于所建立方法退火溫度范圍較廣，適于建立與其他病原的多重檢測(cè)方法。

2.4 PCR敏感性 利用微量核酸測(cè)定儀測(cè)定回收PCR產(chǎn)物的濃度并稀釋作為模板，最終模板濃度為106/5 μL到101/5 μL共計(jì)6個(gè)梯度，并進(jìn)行敏感性擴(kuò)增，結(jié)果見圖4。當(dāng)模板拷貝數(shù)≥102時(shí)有目的條帶，清晰可見，但101拷貝不能通過電泳檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物。兔出血癥病毒RT-PCR診斷方法已有很多報(bào)道[11-15]，但多是以提取的病毒RNA或者病毒稀釋倍數(shù)來判定其敏感性。本研究建立的RT-PCR檢測(cè)方法以擴(kuò)增產(chǎn)物等比稀釋后為模板，得出理論上可以肉眼觀察到的最低擴(kuò)增拷貝數(shù)，在精確其敏感性的同時(shí)增加了其臨床檢測(cè)適用性，即可以檢測(cè)出較低含量的病毒樣本。

圖3 退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Fig.3 PCR results at different annealing temperature

圖4 不同拷貝數(shù)稀釋PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Results of PCR at different copy numbers

2.5 特異性檢測(cè) 該方法特異性測(cè)定結(jié)果如圖5所示，針對(duì)RHDV所設(shè)計(jì)合成引物只對(duì)RHDV能夠獲得特異性擴(kuò)增，而檢測(cè)兔水泡型口炎病毒與兔輪狀病毒時(shí)并無特異性擴(kuò)增，說明所建立的方法特異性強(qiáng)。

2.6 臨床應(yīng)用比較試驗(yàn) 應(yīng)用本研究建立的RHDV RT-PCR檢測(cè)方法與血凝試驗(yàn)（HA）同時(shí)檢測(cè)臨床疑似RHDV感染的臨床組織病料27份，HA檢測(cè)出陽性樣品18份，而本研究建立的RT-PCR方法檢測(cè)出陽性樣品21份。3份HA未檢出的陽性病料攻毒的家兔均在24～72 h內(nèi)死亡，且臨床發(fā)病癥狀與剖檢組織病理學(xué)變均為典型RHD所致，陰性對(duì)照組全部健活。以上結(jié)果表明，所建立的RT-PCR方法較HA檢測(cè)方法具有更高的敏感性，陽性檢出率由66.7%提升至77.8%，具有較強(qiáng)的臨床適用性。由于該病具有潛伏期短、傳播快、病死率高等特點(diǎn)，因此，快速、敏感、準(zhǔn)確的RT-PCR診斷方法的建立對(duì)于該病的臨床防控極為重要。RHDV常規(guī)檢測(cè)最為常用的方法是血凝（血凝抑制）實(shí)驗(yàn)、ELISA等，但血凝（血凝抑制）實(shí)驗(yàn)需要人“O”型紅細(xì)胞，不僅受來源限制，而且對(duì)操作人員存在潛在的生物安全性問題，同時(shí)其敏感性較低，影響其結(jié)果判定的因素也較多。因此，本研究建立的RT-PCR檢測(cè)方法具有敏感、特異、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可用于RHDV的快速診斷，也可用于潛伏攜帶RHDV的大規(guī)模排查與凈化，對(duì)于防控該病提供了技術(shù)保障。

圖5 PCR特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Specificity test of PCR

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