胡 躍，孫英杰，王曉旭，仇旭升，宋翠萍，譚 磊，胡桂學(xué)，丁 鏟

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 223006）

利用PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)鵝RIG-I的DF-1細(xì)胞系

胡 躍1，孫英杰2，王曉旭3，仇旭升2，宋翠萍2，譚 磊2，胡桂學(xué)1，丁 鏟2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 223006）

維甲酸誘導(dǎo)基因-I（retinoic acid inducible gene-I，RIG-I）是最近幾年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體，能夠特異性的識(shí)別并結(jié)合病毒RNA，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。RIG-I在進(jìn)化中相對(duì)保守，但已有報(bào)道和我們的前期研究顯示：家禽中鴨和鵝體內(nèi)均有RIG-I受體，但雞卻缺乏RIG-I受體。為了研究這種天然缺失對(duì)雞是否有不利影響，本研究利用PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將鵝源RIG-I轉(zhuǎn)染入雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1，兩次亞克隆后獲得單個(gè)克隆，以熒光、RT-PCR及Western blot進(jìn)行鑒定，最終獲得穩(wěn)定表達(dá)鵝RIG-I的DF-1細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究雞的先天性免疫機(jī)制和鵝RIG-I的功能打下基礎(chǔ)。

鵝維甲酸誘導(dǎo)基因-I；雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1；PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)

先天性免疫是機(jī)體對(duì)抗外來(lái)病原微生物侵害的第一道屏障，而在感染初期模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別病原微生物入侵機(jī)體后復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的一些保守組分，即病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），是有效發(fā)揮先天性免疫反應(yīng)的第一步[1]。機(jī)體內(nèi)的PRRs目前主要分為四大家族：Toll樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs），RIG-I樣受體家族（RIG-I like receptors，RLRs），NOD樣受體家族（NOD-like receptors，NLRs）和C型外源凝集素受體（C-typed lectin receptors，CLRs）[2]。

維甲酸誘導(dǎo)基因I（retinoic acid inducible gene-I，RIG-I），又稱為視黃酸誘導(dǎo)基因I，2004年由日本科學(xué)家Takahashi首先發(fā)現(xiàn)。RIG-I是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白，N端是兩個(gè)串聯(lián)的半胱天冬酶活化募集結(jié)構(gòu)域（caspase activation and recruitment domain，CARD），中間部分為具有DExD/H盒的RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域，包含與ATP結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，C端是與RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域（RNA-binding domain）和抑制結(jié)構(gòu)域（repressor domain，RD），其中具有RNA識(shí)別、信號(hào)抑制功能的區(qū)域，又稱為C末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）。雖然RIG-I基因在進(jìn)化中相對(duì)保守，但在雞的基因組中并不存在RIG-I的核苷酸序列，這意味著雞先天性缺失這一模式識(shí)別受體[3,4]。雞是我國(guó)各地普遍飼養(yǎng)的一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，與雞相比，鴨和鵝對(duì)許多病毒都有較強(qiáng)的抵抗力，如新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV），目前已有研究表明NDV、AIV侵入機(jī)體后，病毒復(fù)制時(shí)所產(chǎn)生的RNA主要由RIG-I負(fù)責(zé)識(shí)別、結(jié)合[5,6]，激活先天性免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗病毒作用。

PiggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子屬于DNA轉(zhuǎn)座子，能夠針對(duì)基因組TTAA位點(diǎn)進(jìn)行基因插入，具有較高的轉(zhuǎn)座效率。PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)是一種比較理想的非病毒載體，與病毒載體相比，其安全性高、成本低、載體容量大，且操作相對(duì)簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)座效率高、轉(zhuǎn)座后可切離、轉(zhuǎn)座后不引起染色體重排等現(xiàn)象，是目前較理想的轉(zhuǎn)基因載體。為了便于研究雞對(duì)于RIG-I的先天性缺失是否使雞對(duì)于NDV、AIV以及其他病毒更易感，本研究利用PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)鵝源RIG-I基因的雞傳代細(xì)胞系，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞DF-1細(xì)胞由揚(yáng)州大學(xué)秦愛(ài)建教授饋贈(zèng)，用含10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；原代雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblast，CEF）用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；本研究中所用的雞胚為北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 載體和試劑PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)由西北農(nóng)林科技大學(xué)周恩明教授饋贈(zèng)；嘌呤霉素、氨芐青霉素、人β-actin抗體為Sigma公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；內(nèi)切酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；KOD酶為TOYOBO公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000為life Technologies公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑PMSF、疊氮鈉、Western及IP細(xì)胞裂解液、增強(qiáng)型BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、一抗二抗去除液、顯影液定影試劑盒為中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；鵝RIG-I多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 引物設(shè)計(jì)參照GenBank中鵝源RIG-I的CDS（GenBank登錄號(hào)：HQ829831.1），設(shè)計(jì)了包含酶切位點(diǎn)Xba I和EcoR I的擴(kuò)增引物，以及用于RT-PCR鑒定的特異性鑒定引物。同時(shí)針對(duì)PiggyBac載體序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性鑒定引物，以及包含RIG-I及部分載體的鑒定引物。上述3對(duì)鑒定引物均通過(guò)BLAST特異性驗(yàn)證，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.4 細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)分別配制嘌呤霉素終濃度為1～10 μg/mL的含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基。在24孔板內(nèi)飼養(yǎng)DF-1細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)更換為含藥物的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)，每塊6孔板設(shè)1組正常培養(yǎng)基為對(duì)照組。每24 h觀察細(xì)胞形態(tài)并記錄，每3 d更換培養(yǎng)基，持續(xù)8 d。

1.5 PiggyBac-RIG-I質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定鵝源RIG-I擴(kuò)增的PCR體系按照KOD-Plus-Neo DNA Polymeraes使用說(shuō)明配置：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL、2 mmol/L dNTPs 5 μL、25 mmol/L MgSO43 μL、上下游引物各1 μL、模板（Flag-RIG-I[7]）1 μL、滅菌蒸餾水33 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離回收大小為2.8 kb左右條帶，并進(jìn)行純化。將得到的RIG-I片段經(jīng)Xba I/EcoR I酶切后，連入PiggyBac513B-1載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。取200 μL細(xì)胞轉(zhuǎn)化菌液涂布于含100 mg/L 氨芐青霉素的LB平板上，37℃孵育過(guò)夜，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。采用菌液PCR，瓊脂糖凝膠電泳篩選陽(yáng)性克隆，命名為PR-RIG-I，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.6 CEF的制備取10日齡SPF雞胚，用碘酒和酒精棉球消毒蛋殼，無(wú)菌操作下打開(kāi)氣室，去殼后掀開(kāi)殼膜，取出胚體放入平皿中，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基清洗1遍，去除頭、尾、四肢、骨頭、內(nèi)臟。將胚體放于小燒杯中，用剪刀剪碎，1000×g離心3～5 min，棄上清；用3～5倍細(xì)胞體積的濃度為0.25%的胰酶懸浮，放置15 mL離心管中，顛倒數(shù)次，至形成云霧狀；用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1000×g離心3～5 min，棄上清，下層細(xì)胞加入一定量的含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，用力吹打后待其沉淀，吸取上清加到漏斗中進(jìn)行過(guò)濾；將濾液分裝在75 cm2細(xì)胞瓶中（根據(jù)細(xì)胞數(shù)量而定），置37℃培養(yǎng)。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.7 表達(dá)RIG-I的DF-1的構(gòu)建將長(zhǎng)滿單層的DF-1細(xì)胞1.5×105個(gè)/mL接種于6孔板中，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至約80%時(shí)共轉(zhuǎn)染PR-RIG-I及PiggyBac系統(tǒng)輔助質(zhì)粒PB200PA-1，轉(zhuǎn)染24 h后更換藥物培養(yǎng)基壓力篩選，每3 d更換培養(yǎng)基，持續(xù)篩選7 d。7 d后以CEF為飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，以PiggyBac系統(tǒng)自帶的綠色熒光作為鑒定依據(jù)，挑取陽(yáng)性株進(jìn)行第二次亞克隆。第二次亞克隆后的陽(yáng)性株擴(kuò)大培養(yǎng)，持續(xù)傳代，收集第1、5、10、15、20、30代細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)鑒定。兩次亞克隆后，以相同轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染空載體，藥物篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞，作為后續(xù)鑒定的對(duì)照組。

1.8 RT-PCR鑒定加1 mL Trizol到細(xì)胞樣品中，重懸細(xì)胞，室溫放置10 min；加入200 μL氯仿，震蕩混勻，室溫靜置15 min；4℃、12 000×g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至無(wú)RNase的離心管中；加入等體積的異丙醇沉淀RNA，-20℃放置20 min，4℃、12 000×g離心10 min，棄去上清；加1 mL70%乙醇洗滌沉淀，4℃、12 000×g離心5 min，去除上清；吹干后加入無(wú)RNase水溶解RNA，并測(cè)定濃度。反轉(zhuǎn)錄參照Promega公司Reverse Transcription System方法進(jìn)行，最終獲得cDNA。以獲得的cDNA為模板，利用3對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.9 Western blot鑒定加200 μL含PMSF的細(xì)胞裂解液到細(xì)胞樣品中，用槍頭反復(fù)吹打細(xì)胞數(shù)次，冰上靜置10 min后超聲破碎，4℃、12 000×g離心5 min，取上清，按比例加入5×上樣緩沖液，沸水中煮沸10 min，室溫12 000×g離心5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80V恒壓電泳，樣品進(jìn)入分離膠時(shí)將電壓調(diào)至120V，電泳后將凝膠取出，65V恒壓電轉(zhuǎn)印2 h。轉(zhuǎn)印好的纖維素膜置于TBST（含0.05% Tween-20的TBS）中漂洗3次，每次3～5 min，然后置于含10%脫脂乳的TBST中4℃封閉過(guò)夜，TBST漂洗3次，每次6～8 min。加入適量稀釋的多抗血清，37℃作用2 h，TBST漂洗3次。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)羊抗鼠二抗（1: 8000稀釋），作用2 h，以TBST漂洗3次，每次6～8 min，以ECL增強(qiáng)顯色試劑盒顯色。完成后，將NC膜浸入Stripping Buffer中，55℃溫育30 min，期間緩慢振蕩幾次，PBST漂洗3次，每次3～5 min。置于10%脫脂乳的PBST中4℃封閉過(guò)夜，以鼠源β-actin抗體為一抗（1:1000稀釋）和HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗（1:8000稀釋），Western blot分析actin蛋白，ECL增強(qiáng)試劑盒顯色。

1.10 免疫熒光鑒定將5×105個(gè)細(xì)胞接種至已事先放置好滅菌飛片的35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞濃度約70%。去掉培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入4%中性甲醛室溫固定20 min，再用PBS洗滌細(xì)胞3次。在濕潤(rùn)的濾紙上覆蓋保鮮膜，保鮮膜上滴加100 μL以TBS稀釋1000倍的RIG-I多克隆抗體，將含有細(xì)胞的飛片扣上，使飛片上的細(xì)胞與多抗完全接觸，37℃孵育1 h。取出飛片，TBS洗滌3次，取出飛片，TBS洗滌3次，避光，在保鮮膜上滴加100 μL以TBS稀釋200倍的羊抗鼠熒光二抗，再將含有細(xì)胞的飛片扣上，使飛片上的細(xì)胞與多抗完全接觸，37℃避光孵育1 h。避光，在保鮮膜上滴加100 μL的以TBS稀釋成1: 500的DAPI，再將含有細(xì)胞的飛片扣上，使飛片上的細(xì)胞與DAPI完全接觸，37℃避光孵育1 h。取出飛片，TBS洗滌3次，在載玻片上滴加封片劑，將含有細(xì)胞的飛片扣上，用熒光顯微鏡觀察、拍攝。

2 結(jié)果

2.1 DF-1細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素敏感性實(shí)驗(yàn)根據(jù)已報(bào)道的文章，選取嘌呤霉素濃度1～10 μg/mL做DF-1細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)。當(dāng)藥物濃度為3 μg/mL時(shí)，一直有零星細(xì)胞存活，而藥物濃度為4 μg/mL，d 4時(shí)細(xì)胞已全部死亡（圖1），因此選取4 μg/mL作為篩選濃度。

圖1 不同濃度嘌呤霉素對(duì)DF-1細(xì)胞致死率曲線圖Fig.1 Survival rate of DF-1 cells treated with different doses of puromycin

2.2 PiggyBac-RIG-I質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存的質(zhì)粒Flag-RIG-I模板對(duì)鵝源RIG-I進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2），所得目的基因經(jīng)雙酶切后與PiggyBac載體連接，轉(zhuǎn)化后挑取菌斑進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定的正確結(jié)果送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 PB-RIG-I質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 Identifi cation of PB-RIG-I by PCR

2.3 細(xì)胞系熒光鑒定PiggyBac載體自帶綠色熒光蛋白GFP，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果（圖3B）。由于PiggyBac系統(tǒng)為雙啟動(dòng)子系統(tǒng)，因此插入外源片段不會(huì)影響GFP蛋白的定位，轉(zhuǎn)染PBRIG-I的DF-1熒光形態(tài)與轉(zhuǎn)染空載體的一致（圖3C），轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)和亞克隆，每次亞克隆以免疫熒光作為鑒定依據(jù)，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（圖3D）。

2.4 細(xì)胞系RT-PCR鑒定為了檢驗(yàn)鵝RIG-I的細(xì)胞系的穩(wěn)定性，我們將二次亞克隆獲得的陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行連續(xù)傳代，利用RT-PCR對(duì)傳代細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。PiggyBac系統(tǒng)為雙啟動(dòng)子，目的基因和下游的GFP、抗性基因分屬不同啟動(dòng)子，為防止所得單細(xì)胞株為空載體細(xì)胞株，設(shè)計(jì)了3對(duì)RT-PCR鑒定引物，第1對(duì)和第2對(duì)分別為針對(duì)RIG-I基因（圖4A）、GFP基因（圖4B）進(jìn)行鑒定，第3對(duì)上游為RIG-I序列，下游為GFP引物，鑒定區(qū)間包含RIG-I及GFP（圖4C）。結(jié)果顯示：第1、5、10、15、20、30代細(xì)胞株均有RIG-I和GFP的穩(wěn)定表達(dá)，說(shuō)明RIG-I已在DF-1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，而空載體轉(zhuǎn)染組僅有GFP的表達(dá)。

圖3 PB-RIG-I轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞熒光鑒定Fig.3 Fluorescence of DF-1 cells transfected with PB-RIG-I

2.5 細(xì)胞系Western Blot鑒定為了鑒定細(xì)胞系中RIG-I蛋白水平的表達(dá)情況，我們用本實(shí)驗(yàn)室制備的鵝RIG-I多克隆抗體進(jìn)行Western blot鑒定（圖5）。結(jié)果顯示：第1、5、10、15、20、30代細(xì)胞均有RIG-I的穩(wěn)定表達(dá)。

2.6 細(xì)胞系免疫熒光鑒定分別將細(xì)胞系的第1、5、10、15、20、30代置于含有飛片的35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至約70%時(shí)取出細(xì)胞，中性甲醛固定，一抗二抗孵育后，DAPI染色細(xì)胞核，使用封片劑封片后，在熒光顯微鏡下觀察、拍攝。結(jié)果如圖6所示，每組圖片分別為細(xì)胞核DAPI染色、紅色二抗以及合并結(jié)果，其中A組為第1代，B組為第5代，C組為第10代、D組為第15代、E組為第20代、F組為第30代。從結(jié)果可以看出，每組中每個(gè)細(xì)胞都可見(jiàn)紅色熒光，證明了細(xì)胞系能穩(wěn)定表達(dá)RIG-I。

圖4 RT-PCR鑒定表達(dá)鵝RIG-I的DF-1細(xì)胞系的穩(wěn)定性Fig.4 Stability identifi cation of DF-1 cells eqpressing goose RIG-I by RT-PCR

3 討論

雖然發(fā)現(xiàn)較晚，但RIG-I作為先天性免疫中的重要組成成分，越來(lái)越受到研究人員的重視，對(duì)其進(jìn)行的研究也在不斷深入[7,8]。Megan等[9]用禽流感病毒感染雛鴨，發(fā)現(xiàn)RIG-I的表達(dá)水平顯著提高，這也證實(shí)主要由RIG-I負(fù)責(zé)識(shí)別流感病毒。將鴨源RIG-I基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1中，發(fā)現(xiàn)其可以誘導(dǎo)干擾素的表達(dá)。分別用禽流感強(qiáng)（H5N1）弱（H5N2）毒株感染轉(zhuǎn)染RIG-I后的細(xì)胞，可引起干擾素下游基因表達(dá)的上調(diào)，病毒滴度也明顯降低[3]。孫英杰等[10]鑒定出鵝源RIG-I基因，用RIG-I轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后感染NDV，發(fā)現(xiàn)可引起強(qiáng)烈的抗病毒反應(yīng)，病毒滴度也明顯下降。用NDV感染鵝胚成纖維細(xì)胞，也會(huì)引起RIG-I表達(dá)量的上調(diào)。

圖5 Western blot鑒定表達(dá)鵝RIG-I的DF-1細(xì)胞系的穩(wěn)定性Fig.5 Western blot identifi cation of DF-1 cells with stable expressed goose RIG-I

圖6 免疫熒光鑒定表達(dá)鵝RIG-I的PF-1系的穩(wěn)定性Fig.6 Stability identifi cation of DF-1 cells expressing goose RIG-I by immunofl uorescence

RIG-I的天然缺失是否對(duì)雞造成了不利影響，雞對(duì)某些病毒的易感與RIG-I的缺失有沒(méi)有關(guān)系，是目前研究人員的興趣點(diǎn)，也是爭(zhēng)論點(diǎn)。一方面有研究人員認(rèn)為RIG-I基因的缺失導(dǎo)致雞易感禽流感，而另一方面研究人員認(rèn)為同是RIG-I樣受體家族的黑色素瘤分化相關(guān)基因5（melanoma differentiation associated gene 5，MDA5）會(huì)彌補(bǔ)RIG-I的作用，兩種觀點(diǎn)都有實(shí)驗(yàn)依據(jù)[11,12]，目前仍無(wú)法達(dá)成共識(shí)，需要進(jìn)一步的研究。

目前關(guān)于禽類RIG-I的研究較少，一方面集中在病毒感染鴨或鵝后，檢測(cè)組織器官中RIG-I的表達(dá)量及病毒滴度，另一方面是病毒感染鴨或鵝原代細(xì)胞，或者是將鴨或鵝的RIG-I基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入雞傳代細(xì)胞后感染病毒，檢測(cè)干擾素表達(dá)量和病毒滴度。但病毒感染動(dòng)物，僅能說(shuō)明RIG-I在鴨和鵝中是否有抗病毒作用，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染存在諸多限制：例如轉(zhuǎn)染步驟的繁瑣、轉(zhuǎn)染量不一致或轉(zhuǎn)染本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響等[13,14]。本試驗(yàn)利用PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)鵝源RIG-I的細(xì)胞系，將RIG-I基因整合到基因組中，一定程度上縮小了與自然情況的差異，同時(shí)也省去了每次試驗(yàn)時(shí)的轉(zhuǎn)染步驟，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

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CONSTRUCTION OF CHICKEN EMBRYO FIBROBLAST CELL LINE DF-1 STABLY EXPRESSING GOOSE RIG-I THROUGH PIGGYBAC TRANSPOSON SYSTEM

HU Yue1, SUN Ying-jie2, WANG Xiao-xu3, QIU Xu-sheng2, SONG Cui-ping2, TAN-Lei2, HU Gui-xue1, DING Chan2
(1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 3. College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 223006, China)

Retinoic acid inducible gene-I (RIG-I) is a family member of cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs), which acts as a sensor for RNA virus and plays an important role in antiviral innate immunity. RIG-I is evolutionally conserved among most species. However, several reports and our previous studies have identifi ed that receptors for RIG-I exist in both ducks and geese, but not in chickens. To investigate whether this natural loss of RIG-I plays a negative role in chicken, goose RIG-I was transfected into chicken embryo fi broblast cell line DF-1 through PiggyBac transposon system. Monoclonal cells were obtained from twice sub-cloned cultures. DF-1 cells stably expressing goose RIG-I were identifi ed by detection of fl uorescence, RT-PCR and Western blot. The present study has laid the foundation for future research on mechanism of chicken innate immunity and function of goose RIG-I.

Goose retinoic acid inducible gene-I(RIG-I); chicken embryo fi broblast cell line DF-1; Piggy-Bac transposon system

S852.42

A

1674-6422（2014）03-0053-08

2014-02-14

863計(jì)劃（2011AA10A209）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101822）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2014JB08）

胡躍，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

丁鏟，E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn；胡桂學(xué)，E-mail：huguixue901103@163.com