董蓮華， 李 亮， 周云龍， 曹應龍，沈 平， 盧長明， 王 晶， 劉張嵐

（1.中國計量科學研究院，北京 100013； 2.農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122；3.中國農(nóng)科院油料作物研究所，湖北武漢 430062）

轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標準物質(zhì)協(xié)同實驗研究

董蓮華1， 李 亮1， 周云龍2， 曹應龍3，沈 平2， 盧長明3， 王 晶1， 劉張嵐1

（1.中國計量科學研究院，北京 100013； 2.農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122；3.中國農(nóng)科院油料作物研究所，湖北武漢 430062）

對轉(zhuǎn)基因玉米T25轉(zhuǎn)化體特異性熒光定量PCR方法的關(guān)鍵參數(shù)進行了方法驗證，選擇了7家實驗室采用經(jīng)過驗證的方法對3個水平的轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標準物質(zhì)進行協(xié)同實驗研究。通過比較分析各參與實驗室的實驗條件、標準曲線的參數(shù)，進一步證明該方法室間重復性好。經(jīng)統(tǒng)計學分析各參與實驗室的數(shù)據(jù)等精度，因此計算各實驗室的總平均值做為標準物質(zhì)的標準值。3個水平的基體標準物質(zhì)的標準值和擴展不確定度（k＝2）分別為1.17%±0.22%、2.17%±0.38%和9.81%±2.30%。

計量學；轉(zhuǎn)基因玉米；T25；基體標準物質(zhì)；實時熒光定量PCR

1 前 言

轉(zhuǎn)基因玉米在全球范圍的大面積種植，使其食用安全和環(huán)境安全問題引起了各國政府和相關(guān)國際組織的高度重視，各國紛紛出臺了轉(zhuǎn)基因生物安全管理相應的法規(guī)，這對轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)的靈敏度和準確性提出了挑戰(zhàn)。目前我國農(nóng)業(yè)部已頒布了轉(zhuǎn)基因玉米定性PCR檢測方法的國家標準，然而尚缺乏轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)品的標準物質(zhì)，而無法保證轉(zhuǎn)基因檢測結(jié)果的準確、可靠和可比性，因此加快轉(zhuǎn)基因玉米標準物質(zhì)的研制勢在必行。

轉(zhuǎn)基因玉米T25為拜耳公司生產(chǎn)的具有草丁膦抗性的轉(zhuǎn)基因玉米，該品種中Camv35s啟動子與nos終止子一同控制草丁膦抗性基因PAT。PAT是來源于桿菌Bacillus amyloliquefaciens草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，它能使草丁膦中游離氨基乙?；Щ睢AT與已知的120多種人體蛋白無同源性。目前，美國、澳大利亞、加拿大、阿根廷、日本等國家已批準該轉(zhuǎn)基因玉米在飼料中使用。為了加強對該轉(zhuǎn)基因玉米的檢測，美國油料化學學會（AOCS）已經(jīng)研制了該玉米的葉片基因組DNA分子標準物質(zhì)［1］。目前對于生物標準物質(zhì)，尤其是轉(zhuǎn)基因標準物質(zhì)，可參考的定值方法較少，實時熒光定量PCR方法是目前可以進行轉(zhuǎn)基因定量檢測比較成熟的方法［2～4］，本文選擇多家協(xié)同定值方式對研制的基體標準物質(zhì)進行協(xié)同研制，并且使用的定值方法（轉(zhuǎn)基因玉米T25轉(zhuǎn)化體特異性和玉米內(nèi)標基因特異性定量PCR方法）是經(jīng)過歐盟確認的標準方法［5］，但在使用該方法定值前本文先對方法進行了驗證［6］，然后選擇6～8家實驗室采用實時熒光定量PCR方法對研制的轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標準物質(zhì)進行聯(lián)合定值。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 轉(zhuǎn)基因玉米T25陽性和陰性材料

轉(zhuǎn)基因玉米T25陽性和陰性材料由農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心提供；轉(zhuǎn)基因玉米T25 A、B、C 3個含量水平基體標準物質(zhì)：由中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所研制；轉(zhuǎn)基因玉米T25陽性基因組DNA，購自美國油料化學會（AOCS）標準值（轉(zhuǎn)基因質(zhì)量比）大于999.9 ng／μg，不確定度可以忽略（詳見該標準物質(zhì)證書）。

2.1.2 主要試劑

植物基因組DNA提取試劑盒、購自天根生化科技有限公司，定量PCR試劑盒購自美國ABI北京分公司。

2.1.3 特異性引物和探針

本實驗所使用的引物探針均由上海英俊公司合成。其中探針5’端采用熒光標記基團FAM進行標記，3’端采用熒光淬滅基團TAMRA進行標記。具體序列參考歐盟公開發(fā)布的轉(zhuǎn)基因玉米T25轉(zhuǎn)化體特異性方法驗證報告［5］，見表1。

表1 Taqman探針實時PCR檢測引物和探針序列信息

2.2 方法

2.2.1 樣品DNA的提取

采用天根生化科技公司的植物DNA抽提試劑盒（離心柱型）對樣品的基因組DNA進行提取，具體過程見試劑盒說明書。

2.2.2 紫外分光光度法檢測提取DNA純度

用1×TE0.1做空白采用紫外分光光度計進行測定A260、A280和A320的紫外吸收值，然后將提取的DNA溶液分別測定A260、A280和A320下的紫外吸收值。以A320作為背景吸收計算出樣品DNA溶液在260 nm、280 nm處的紫外吸收值。

2.2.3 熒光染料法測定DNA濃度

為能準確測定DNA的濃度，本實驗采用熒光染料法，即PicoGreen dsDNA定量試劑盒法測定提取DNA溶液的濃度。實驗中使用的熒光染料P7589能特異性的結(jié)合雙鏈DNA，因此可以特異性測定雙鏈DNA的濃度，受單鏈DNA、RNA和蛋白質(zhì)的影響較小。

2.2.4 實時熒光定量PCR擴增

經(jīng)過純度鑒定后提取的DNA進行實時熒光定量PCR擴增，擴增所用的引物探針及濃度見表1。擴增程序為：95℃，10 min；95℃15 s，60℃1 min，50個循環(huán)。

2.2.5 標準曲線的制作

將基因組DNA標準物質(zhì)用熒光染料法測定濃度，計算溶液中含有的基因組的拷貝數(shù)，然后采用梯度稀釋法對基因組DNA溶液進行稀釋。分別稀釋5個梯度，作為標準溶液。取5μL已稀釋的基因組DNA標準溶液，按照本文第2.2.4節(jié)中描述的熒光定量PCR條件進行擴增。擴增后得到以拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，以Ct值為縱坐標的標準曲線。

式中，［DNA］為測定的基因組溶液的質(zhì)量濃度，g／L；MW為基因組的分子量大小，其中基因組大?。▔A基對）為2 500×106。

定量PCR的擴增效率計算式為

E為擴增效率；ks為標準曲線的斜率。

3 實驗結(jié)果

3.1 方法驗證

3.1.1 樣品DNA的質(zhì)量檢查

根據(jù)OD260／OD280的比值，確定提取DNA的純度，當比值為1.8～2.0之間說明樣品DNA質(zhì)量滿足實驗要求。轉(zhuǎn)基因玉米T25標準物質(zhì)樣品提取DNAA260／A280比值均處在1.8～2.0之間，見表2，表明提取的DNA質(zhì)量純度符合要求。

表2 轉(zhuǎn)基因玉米T25基因組DNA質(zhì)量分析（n＝5）

3.1.2 標準曲線參數(shù)

對其線性擴增效率和線性相關(guān)性進行評價。PCR擴增產(chǎn)生的標準曲線的斜率必須在－2.9～－3.7，線性相關(guān)系數(shù)＞0.985，見表3，因此斜率和線性相關(guān)系數(shù)均滿足要求［7］。

表3 轉(zhuǎn)基因玉米T25內(nèi)、外標準基因定量PCR擴增效率和線性相關(guān)系數(shù)

3.1.3 重復性

在對建立的轉(zhuǎn)基因玉米T25定量PCR檢測方法內(nèi)、外標準基因的擴增效率，線性相關(guān)系數(shù)等參數(shù)進行驗證后，用建立的定量PCR方法對轉(zhuǎn)基因玉米T25基體A、B、C 3個梯度水平的樣品進行了定量分析。結(jié)果顯示，所有樣品定量分析的相對標準偏差RSD在25%之內(nèi)，說明轉(zhuǎn)基因玉米T25定量PCR方法的重復性能夠滿足定量的要求［7］，可用于該基體物質(zhì)的定值。

表4 轉(zhuǎn)基因玉米T25定量PCR檢測重復性（n＝9）

3.2 協(xié)同實驗驗證

3.2.1 協(xié)同實驗結(jié)果

上述方法經(jīng)過方法驗證可用于轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標準物質(zhì)定值，選擇有資質(zhì)的實驗室使用該方法對轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標準物質(zhì)進行協(xié)同實驗。每個參與協(xié)同實驗的實驗室對3個待測定樣品進行3次重復測定，每次重復測定至少設(shè)置3個平行。

此次協(xié)同實驗中選擇了7家實驗室，7家實驗室使用了不同的定量PCR儀器、不同的儀器分析軟件以及不同的基線設(shè)定方法。實驗室使用的定量PCR儀器主要是ABI系列，Rotor-Gene 3000A和bio-rad系列定量PCR儀?；€和閾值的設(shè)置除1家實驗室外，其余6家均采用自動設(shè)置。從各實驗室定量PCR標準曲線參數(shù)可以看出，不同的PCR儀器均得到了較好的擴增效率和線性相關(guān)系數(shù)，進一步說明轉(zhuǎn)基因玉米T25定量PCR體系適用于不同的PCR儀器，具有較好的穩(wěn)定性。

各實驗室定量PCR的線性相關(guān)系數(shù)和擴增效率以及定量標準曲線斜率的計算結(jié)果見表5，由表中結(jié)果可以看出，7個實驗室構(gòu)建的定量標準曲線的內(nèi)標準基因擴增效率在0.87～0.96之間，平均值為0.93，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。外標準基因擴增效率在0.83～0.93之間，平均值為0.89，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。說明各家實驗室所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因玉米T25定量PCR標準曲線符合定量要求，具有較好的擴增效率和線性相關(guān)系數(shù)。

表5 各實驗室定量PCR的擴增效率和線性相關(guān)系數(shù)

3.2.2 標準物質(zhì)量值

根據(jù)一級標準物質(zhì)研制規(guī)范［8］中對采用多個實驗室合作定值時數(shù)據(jù)處理要求，首先考察各實驗室全部測量數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，經(jīng)統(tǒng)計分析，3個水平的基體標準物質(zhì)測定結(jié)果均服從正態(tài)分布。然后將各實驗室測量結(jié)果的平均值視為一組新的數(shù)據(jù)，再對各家平均值采用格拉布斯準則進行離群值檢驗［9］，經(jīng)檢驗并沒有發(fā)現(xiàn)離群值。最后用科克倫（Cochran）法檢查各組數(shù)據(jù)之間是否等精度［10］，經(jīng)檢驗各家數(shù)據(jù)等精度，因此計算其總平均值及其標準偏差，所得算術(shù)平均值即為該標準物質(zhì)的標準值，見表6。

表6 多家協(xié)同實驗結(jié)果

3.2.3 不確定度評定

轉(zhuǎn)基因玉米T25定值結(jié)果的不確定度由兩部分組成，第一部分是定值結(jié)果的A類標準不確定度uA，第二部分是定值方法的B類標準不確定度uB。

A類不確定度uA是通過測量數(shù)據(jù)的標準偏差、測量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計方法計算出的不確定度。通過分析，各實驗室的數(shù)據(jù)平均值等精度，因此A類不確定度的具體計算方法為：

對標準物質(zhì)的特性量進行測定時，由m個實驗室進行測定，每個實驗室測定平均值為測定數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，間等精度為

B類不確定的主要來源包括：（1）移液器帶來的不確定度；（2）標準溶液系列稀釋帶來的不確定度；（3）標準物質(zhì)引入的不確定度。由標物證書可知，標準物質(zhì)的不確定度可以忽略，因此B類不確定評定僅考慮前2個因素。

表7 轉(zhuǎn)基因玉米T25基體標準物質(zhì)的標準值及不確定度（%）

4 總 結(jié)

對轉(zhuǎn)基因玉米T25定量PCR方法進行了方法驗證研究，測試了定量標準曲線、線性相關(guān)性、PCR擴增效率、重復性等主要技術(shù)參數(shù)，經(jīng)過驗證，該方法滿足標準物質(zhì)定值要求。組織了7家實驗室對轉(zhuǎn)基因玉米T25 A、B、C 3個水平的基體標準物質(zhì)進行了協(xié)同定值，對多家定值的數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計分析。經(jīng)分析得出，轉(zhuǎn)基因玉米T25 A、B、C 3個水平的轉(zhuǎn)基因質(zhì)量分數(shù)分別為0.99%、1.61%和10.38%，擴展標準不確定度（K＝2）分別為0.22%、0.38%和2.3%。

［1］ AOCS0306-H3＋Certificate［EB］.https：／／secure.aocs. org／crm／files／0306H3-Certificate.pd f，2011-08-05.

［2］ R?nning SB，Va?tilingom M，Berdal K G，etal.Event specific real-time quantitative PCR for genetically modified Bt11 maize（Zea mays）［J］.EuropeanFood ResearchTechnology，2003，216（4）：347－354.

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［7］ ENGL.Definition of minimum performance requirements for analyticalmethods of GMO testing［R］.EUR 23696 EN，2008.

［8］ JJG 1006—94，一級標準物質(zhì)技術(shù)規(guī)范［S］.

［9］ ISO Guide 35：2006，Reference materials—General and statistical princip les for certification［S］.

［10］ JJF 1343—2012，General and statistical principles for characterization of referencematerials［S］.

Characterizing on Genetically Modified T25 Maize Line Matrix Reference Material

DONG Lian-hua1， LILiang1， ZHOU Yun-long2， CAO Ying-Long3，SHEN Ping2， LU Chang-ming3， WANG Jing1， LIU Zhang-lan1
（1.National Institute of Metrology，Beijing100013，China；
2.Science and Technology Development Center，Ministry of Agriculture，Beijing 100122，China；
3.Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Science，Wuhan，Hubei430062，China）

To validate the key parameters of the real time PCR method for GM maize T25，7 different laboratories are chosen to assign the reference values of three different GM content matrix reference materials by using the same method.Although different types of instruments are used by different labs，the standard curve generated by each lab is comparable which indicated that thismethod shows a good reproductablity.After statistically analyzing the data gained from seven labs，the totalmeans are assigned to be the reference values.The reference values and expanded uncertainties（k＝2）for threematrix GM referencematerial are 1.17%±0.22%，2.17%±0.38%and 9.81%±2.30%.

Metrology；Geneticallymodified maize；T25；Matrix referencematerial；Real time quantitative PCR

TB99

A

1000-1158（2014）01-0087-05

10．3969／j．issn．1000-1158．2014．01．18

2011-09-05；

2013-05-20

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2008ZX08012-003）；科技支撐項目（2008BAK41B01）

董蓮華（1981－），河北淶水，中國計量科學研究院助理研究員，博士，主要從事微生物轉(zhuǎn)基因核酸標準物質(zhì)研究。lianhuadong＠gmail.com