葉含笑， 金紅婷， 袁 昕， 江依法

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053； 2.浙江大學(xué)，浙江杭州 310013）

基于視覺模型的蘇木精—伊紅染色法染色病理切片骨小梁提取

葉含笑1， 金紅婷1， 袁 昕2， 江依法1

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053； 2.浙江大學(xué)，浙江杭州 310013）

為了提取HE染色骨組織切片的骨小梁，實(shí)現(xiàn)骨小梁面積定量檢測，以極坐標(biāo)擴(kuò)散方式創(chuàng)建視覺模型，劃分骨小梁與骨細(xì)胞、骨皮質(zhì)的邊界。提取背景某一像素的RGB值，把病理切片所有像素的RGB值對背景像素求取三維歐式距離，獲得閾值，對圖像二值化分割，通過區(qū)域填充獲得骨小梁。結(jié)果表明視覺模型能較好地獲得感興趣區(qū)域的邊界，計(jì)量的骨小梁面積精度高于常規(guī)軟件，檢測結(jié)果魯棒性相對于常規(guī)軟件提高了95%以上，人機(jī)交互少，降低了檢測的盲目性，提高了檢測速度。

計(jì)量學(xué)；骨組織形態(tài)；蘇木精—伊紅染色法；視覺模型；RGB顏色模型；歐氏距離；圖像分割

1 引 言

骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)被廣泛應(yīng)用于代謝性骨病發(fā)生發(fā)展機(jī)制、抗骨質(zhì)疏松癥藥物等研究［1］，能較全面、準(zhǔn)確地反映骨的新陳代謝過程［2］，但骨組織形態(tài)定量檢測始終沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，究其原因目標(biāo)區(qū)域的選擇和提取是定量檢測需要解決的難題。一些文獻(xiàn)［3～5］和教科書［6］對骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測量方法歸納為顯微鏡目鏡網(wǎng)格測微尺測定、電腦自動(dòng)分析系統(tǒng)測定或根據(jù)脂肪細(xì)胞與造血組織所占面積或容量（volume）憑經(jīng)驗(yàn)測定。三角測量法［7］（triangulation，TRI）是定量分析骨小梁的方法之一，但測量精度較低；其次是平均截距長度法［8］（Mean Intercept Length，MIL），該方法可以計(jì)算測試線在感興趣區(qū)域（Region of Interest，ROI）內(nèi)部的截距長度，但人機(jī)交互繁瑣。具有代表性的半自動(dòng)或全自動(dòng)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)有OsteoMeasure（OM）［9］，BioquantOsteoⅡ［10］等，近年來的文獻(xiàn)報(bào)道［11］多用Image professional plus（IPP）軟件，通用軟件需要解決以下一些問題：如何告訴計(jì)算機(jī)，哪些是骨小梁及感興趣區(qū)域，哪些是骨小梁連接點(diǎn)，哪些又是骨小梁游離末端等，但靈敏度和穩(wěn)定性等往往不盡如人意。在輪廓識別和提取中，吳鳳和［12］提出了計(jì)算機(jī)視覺測量方法，在特定領(lǐng)域起到了較好效果。本文在骨組織切片ROI獲取中模擬人類視覺對色調(diào)、明暗、飽和度等辨別能力，采用多特征方法成功獲取了HE染色后的骨小梁。

2 算法分析

骨小梁是骨皮質(zhì)在松質(zhì)骨內(nèi)的延伸部分，即骨小梁與骨皮質(zhì)相連接，在骨髓腔中呈不規(guī)則立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，如絲瓜絡(luò)樣或海綿狀，起支持造血組織的作用，正常情況下，骨小梁具有一定的長度，它們之間有一定距離。蘇木精—伊紅染色法（hematoxylineosin staining），簡稱HE染色法，蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。圖1和圖2為HE染色后的小鼠脊椎病理切片。

圖1 小鼠脊柱HE染色病理切片1

圖2 小鼠脊柱HE染色病理切片2

圖1為骨皮質(zhì)內(nèi)骨小梁和骨細(xì)胞的一部分，圖2包括肌肉組織、骨皮質(zhì)、骨小梁和骨細(xì)胞。觀察圖1和圖2的骨小梁和骨細(xì)胞、骨小梁和骨皮質(zhì)，具有明顯的顏色差異，從肉眼觀察，骨小梁與其他組織之間邊界非常明顯，骨小梁和骨細(xì)胞之間隔著白色帶并且有深色雜質(zhì)相連；骨小梁和皮質(zhì)之間顏色界限分明，從人類視覺上瞬間就能界定骨小梁的區(qū)域，但卻無法量化計(jì)算出骨小梁的面積，讓計(jì)算機(jī)識別骨小梁是獲得骨小梁量化指標(biāo)的前提條件。

病理切片骨小梁與骨細(xì)胞內(nèi)核及肌肉組織在色彩和顏色深度上有重復(fù)，但骨細(xì)胞與骨小梁之間有比較明顯的白色帶邊界，白色邊界不連續(xù)部分，色塊成粗粒狀，顏色較深。視覺對圖1所示骨小梁的判斷可通過骨細(xì)胞形狀、并結(jié)合骨小梁邊界完成，因此可通過顏色梯度，形狀的延續(xù)性和相似性創(chuàng)建數(shù)學(xué)模型來模擬人類視覺功能。以病理切片相同組織的顏色相似性和形狀的連續(xù)性將邊界模糊的地方區(qū)分開來，然后填充區(qū)域，獲得ROI，圖2骨組織切片的組織結(jié)構(gòu)相對完整，包含了骨皮質(zhì)與肌肉組織，而骨皮質(zhì)與骨小梁交界處顏色梯度明顯，將骨皮質(zhì)與骨小梁分割后與肌肉組織形成封閉的白色帶以后，也可以通過區(qū)域填充獲得ROI。

3 視覺模型

模擬人類通過骨小梁上的點(diǎn)擴(kuò)散到骨小梁邊界來獲得骨小梁區(qū)域的方法，根據(jù)點(diǎn)到面的擴(kuò)散原理創(chuàng)建視覺模型，對HE染色病理切片骨小梁區(qū)域的進(jìn)行提取，具體方法為參考人類視覺從感興趣區(qū)域點(diǎn)到面的擴(kuò)散過程，創(chuàng)建基于極坐標(biāo)方程的擴(kuò)散模型，模擬人類對顏色梯度的感知以及邊界形狀的相連相似的性質(zhì)，確定骨皮質(zhì)和骨小梁色帶邊界上的點(diǎn)，以像素作為極坐標(biāo)單位長度，以色帶邊界上的點(diǎn)為中心，調(diào)整網(wǎng)格數(shù)量M和N，M為極坐標(biāo)單位長度，N表示極坐標(biāo)單位角度倍數(shù)，兩者都以像素為單位，通過對N角度大小的判斷及M長度內(nèi)像素顏色深度閾值來求得色帶邊界，劃分骨小梁區(qū)域，并以此獲得邊界上被刪除區(qū)域S（ri，θj），極坐標(biāo)模型描述如下。

設(shè)R是骨小梁與細(xì)胞邊界點(diǎn)組合的區(qū)域（色帶邊界），P＝｛（x，y）|（x，y）∈R｝，設(shè)區(qū)域R的幾何中心坐標(biāo)為R（xc，yc），則得到集合P（x，y）的“極坐標(biāo)”表示為（r，θ）相應(yīng)的變換公式如下：

式中，r為任意點(diǎn)P（x，y）到幾何中心R（xc，yc）的矩離，它描述了各點(diǎn)對幾何中心點(diǎn)的徑向分布，表示區(qū)域R對其幾何中心的展開程度；θ描述了該區(qū)域的角向分布，表示其在某一角度范圍內(nèi)的分布情況。設(shè)集合P中幾何中心點(diǎn)最遠(yuǎn)點(diǎn)為rmax，其與幾何中心點(diǎn)的距離為

如果將徑向分成M（M為正整數(shù)）等份，將角向均分成N（N為正整數(shù)）等份，則徑向dr（r代表極徑）與角向da（a代表極角）的間隔分別為

于是，區(qū)域P（色帶邊緣）被劃分成一系列網(wǎng)格區(qū)域（共M×N個(gè)），而網(wǎng)格S（ri，θj）則可以表示為

判斷區(qū)域S（ri，θj）內(nèi)像素顏色深度的閾值，調(diào)整M和N的大小，在S（ri，θj）區(qū)域內(nèi)滿足顏色像素密度或顏色深度低于給定的閾值時(shí)即填充為白色，將骨小梁與骨細(xì)胞和骨皮質(zhì)邊界分割開。效果如圖3和圖4所示。

圖3 獲得邊緣圖像1

至此，計(jì)算機(jī)獲得了骨小梁和其他肌肉組織的邊界，通過二值化圖像分割，以及區(qū)域填充得到骨小梁病理切片。

圖4 獲得邊緣圖像1

兩點(diǎn)間歐式距離的數(shù)學(xué)模型及屬性如下所示：

設(shè)ξ，η∈V，將|ξ－η|稱為ξ與η間的距離，記為d（ξ，η），即

根據(jù)以上歐式距離的屬性，以x1代表骨組織切片任意點(diǎn)的像素RGB顏色模型中的R值，y1代表任意點(diǎn)像素的G值，z1代表任意點(diǎn)像素的B值。x2，y2，z2分別代表背景像素的RGB值。

由上所述任意點(diǎn)像素與背景像素點(diǎn)RGB顏色之間的歐式距離可以用算術(shù)表達(dá)為：

通過顏色歐式距離計(jì)算，在d大于最后一個(gè)像素與背景顏色的歐式距離的情況下，顏色取值為1，其他為0，假如背景顏色不均勻可適當(dāng)調(diào)整不等號右邊的值，d為二值化最優(yōu)自適應(yīng)調(diào)整參數(shù)。并對二值化分割后的圖像進(jìn)行區(qū)域填充。由于骨小梁染色不均勻等原因，骨組織切片顯微圖像上的骨小梁會(huì)出現(xiàn)針尖樣的空隙，這些空隙被稱為噪聲，對填充后的圖像進(jìn)行先膨脹后腐蝕的操作，即可去除噪聲。先膨脹后腐蝕的過程稱為閉運(yùn)算。它具有填充物體內(nèi)細(xì)小空洞，連接斷開的鄰近目標(biāo)，平滑邊界的同時(shí)通過閉運(yùn)算并不明顯改變ROI面積。圖5和圖6為處理完成的骨小梁二值化圖像。

在圖5和圖6基礎(chǔ)上，很容易就能獲得骨小梁計(jì)量學(xué)上的二維分量如骨小梁面積，通過公式運(yùn)算獲得骨小梁密度等其他組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)。為了對比算法的穩(wěn)定性，對50張骨組織切片進(jìn)行了相同的操作，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定性、精度和計(jì)算的速度均高于常規(guī)使用的軟件。圖7為狗骨組織切片染色后的效果，圖8為提取到骨小梁的骨組織切片。

圖5 分割后獲得骨小梁1

圖6 分割后獲得骨小梁2

圖7 對照小組原圖像

4 檢測結(jié)果對比

圖8 分割效果

相對于通用的常規(guī)軟件Osteo Measure（OM），Bioquant OsteoⅡ及IPP基于視覺模型的圖像分割方法準(zhǔn)確度和運(yùn)算速度都有顯著提高。IPP軟件目標(biāo)區(qū)域的選擇最有用處的工具有兩個(gè)。一個(gè)就是segmentation工具，另一個(gè)是irregular工具。segmentation工具通過對目標(biāo)區(qū)域的顏色來實(shí)現(xiàn)AOI的提取，而HE染色病理切片中骨小梁、骨細(xì)胞、骨皮質(zhì)乃至肌肉組織都交叉混淆有相同顏色的像素，因此在AOI提取上segmentation工具會(huì)把各組織相同顏色像素混淆在一起。irregular工具是用來描繪不規(guī)則孤立對象邊界的工具。觀察病理切片，骨小梁與骨皮質(zhì)及骨細(xì)胞邊界大量粘連，直接用irregular工具描繪骨小梁邊界工作量巨大，在邊界中有很多不同組織的相連像素顏色值一致，無法用自帶的AUTO工具來選擇邊界。因此也不是最優(yōu)選擇。IPP軟件對圖1和圖2中AOI的提取效果和精度都達(dá)不到后續(xù)測量的要求。為此用IPP對感興趣區(qū)域相對清晰的圖7進(jìn)行了IPP的操作，segmentation工具提取的骨小梁如圖9所示。

圖9 黑色部分為骨小梁區(qū)域

本次對照測試樣例的檢測由5位經(jīng)驗(yàn)豐富的骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測專家完成，檢測對象為圖7所示病理切片，通過視覺模型分割的骨小梁面積檢測和IPP軟件、浙江省骨傷研究所購買的骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析設(shè)備和OM骨形態(tài)計(jì)量系統(tǒng)計(jì)算獲得骨小梁面積檢測對照如表1所示。

采用IPP軟件和OM骨形態(tài)計(jì)量系統(tǒng)由不同檢測員檢測的骨小梁面積各不相同，由此可見常規(guī)軟件對骨組織感興趣區(qū)域的選擇具有主觀判斷依賴性，其結(jié)果的穩(wěn)定性受檢測員經(jīng)驗(yàn)影響較大。而視覺模型檢測軟件由于感興趣區(qū)域ROI劃分標(biāo)準(zhǔn)一致，因此獲得的結(jié)果統(tǒng)一，5位檢測員采用IPP軟件獲得的骨小梁面積平均后得到的值為1 935 363像素，OM檢測軟件獲得的骨小梁平均面積值為1 935 406，與視覺模型獲得的檢測結(jié)果1 935 379分別相差16像素和27像素，基于視覺模型的檢測軟件獲得的結(jié)果非常接近于多名成員通過常規(guī)軟件檢測的平均值，可見該模型獲得的骨小梁面積不僅結(jié)果穩(wěn)定，而且檢測值具有較好的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 骨小梁面積檢測結(jié)果對照表像素

5 討 論

模擬人類視覺掃描方式，創(chuàng)建多特征融合視覺模型獲得的檢測結(jié)果穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于常規(guī)檢測軟件，視覺模型獲得的骨小梁面積更接近于通用軟件多人次檢測后的平均值。由此可見參考人類視覺對圖像感興趣區(qū)域的獲取方法，把目標(biāo)區(qū)域的幾何形狀、顏色梯度、邊緣曲度多特征融合，并由此創(chuàng)建視覺掃描模型將會(huì)使感興趣區(qū)域獲取更具魯棒性和準(zhǔn)確性，在圖像識別的普適性上也會(huì)表現(xiàn)出越來越明顯的優(yōu)勢。

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Extract Bone Trabecular of Hematoxylin-eosin Staining Dyeing Pathological Section by VisualModel

YE Han-xiao1， JIN Hong-ting1， YUAN Xin2， JIANG Yi-fa1
（1.Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou，Zhejiang 310053，China；
2.Zhjiang University，Hangzhou，Zhejiang 310013，China）

To extract trabecular bone of hematoxylin-eosin staining staining bone tissue pathological slices，for quantitative detection of trabecular bone area，create a polar diffusion model，to let computer extract any hematoxylin-eosin staining dyeing bone slice trabecular bone，divide the boundary of the trabecular bone with bone cells and bone cortex. Extract a pixel's RGB values of background，use RGB color value of all pixels with the background pixels to calculate 3d euclidean distance，get threshold，to achieve image binarization segmentation，by area filling get trabecular bone.Results show that the visual model can get the boundary of the region of interest well.Measurement accuracy and speed are significantly improved.Results of measurement relative to the conventional software the robustness improve over 95%，reduce human-computer interaction，to reduce the blindness of testing.

Metrology；Bone tissue morphology；Hematoxylin-eosin staining；Visual model；RGB color model；Euclidean distance；Image segmentation

TB99

A

1000-1158（2014）03-0291-05

10．3969／j．issn．1000-1158．2014．03．20

2012-10-11；

2013-04-01

2013年浙江省教育廳計(jì)劃（FX2013047）；浙江省錢江人才計(jì)劃（QJD0802007）

葉含笑（1974－），女，浙江東陽人，浙江中醫(yī)藥大學(xué)副教授，主要從事圖像處理、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)研究。yhx＠zcmu.edu.cn