陳 華 （山東省畜牧獸醫(yī)信息中心 山東 濟南 250022）陳 靜 田夫林 王貴升 王苗利 孫圣福 馬慧玲 孔祥華 李玉杰 徐 鴻 藺曉月（山東省動物疫病預(yù)防與控制中心 山東 濟南）

2009-2013年山東省H5亞型禽流感抗體檢測

陳 華 （山東省畜牧獸醫(yī)信息中心 山東 濟南 250022）
陳 靜*田夫林 王貴升 王苗利 孫圣福 馬慧玲 孔祥華 李玉杰 徐 鴻 藺曉月（山東省動物疫病預(yù)防與控制中心 山東 濟南）

本研究自2009年起至2013年底對山東省17地市家禽血清抗體進行了監(jiān)測。共采集家禽血清樣品26678份，采用HI試驗進行了H5亞型禽流感Re-4株抗體和Re-5株抗體檢測，分別檢測有25959、25825份樣品合格，免疫合格率97.3%和96.8%，2010年秋季之后，家禽血清抗體檢測合格率達到了100%。種禽場的免疫合格率明顯高于商品化規(guī)模場，商品化規(guī)模場高于散養(yǎng)戶。

山東省 H5亞型禽流感 抗體 監(jiān)測 分析

禽流感(Avian influenza, AI)是禽流行性感冒的簡稱，它是指由禽流感病毒引起的一種動物傳染病，常發(fā)生在禽，有時也發(fā)生在低等哺乳類動物，至今在人僅有偶發(fā)病例。其主要癥狀表現(xiàn)為從亞臨床感染到輕重度的呼吸道感染，產(chǎn)蛋下降甚至嚴重致死性疾病，其嚴重程度取決于病毒毒株以及被感染禽的種類，日齡和有無并發(fā)癥等因素。其中H5和H7:兩個血清型可以引起高致病性禽流感(HPAI)，以傳播快、發(fā)病快、死亡率高為特征，?？蓪?dǎo)致感染雞群的全軍覆沒，造成嚴重的經(jīng)濟損失，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類烈性傳染病，并被列入國際衛(wèi)生武器公約動物類傳染病名單[1]。中致病性的主要指H9N2和 H6N8亞型毒株，其他的毒株均為低的、非致病性的。禽流感病毒不僅會給養(yǎng)禽、畜牧業(yè)帶來災(zāi)難性的破壞，而且對公共健康也構(gòu)成了嚴重威脅。因此，禽流感的危害已引起世界各國普遍關(guān)注。尤其自1997年香港發(fā)生高致病性禽流感后，禽流感感染人不斷增多，我國內(nèi)地近來人群中也出現(xiàn)了禽流感病死病例，流行范圍不斷擴大，給全球的養(yǎng)禽業(yè)市場造成很大沖擊，同時給人類安全造成巨大威脅。

禽流感病毒是單股負鏈分節(jié)段的RNA病毒，屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)。正黏病毒科有5個屬，即甲型流感病毒屬(Influenza virus A)、乙型流感病毒屬(Influenza virus B)、丙型流感病毒屬(Influenza virus C)、索戈托病毒屬(Thogoto virus)[2]和傳染性鮭魚貧血癥病毒屬(Isa -virus)[3]。根據(jù)其病毒核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(MS)抗原性的不同，分為A、B、C 3個血清型[4]。A型流感病毒根據(jù)其致病力的不同，分為高致病性病毒(HPAIV)、中致病病毒(MPAIV)和低致病病毒(LPAIV)3種[5]。

禽流感分為非致病性、低致病性、高致病性禽流感三大類，前兩類發(fā)病癥狀較輕，對養(yǎng)禽業(yè)造成的影響相對較小，屬于溫和性禽流感，而高致病性禽流感一旦暴發(fā)，發(fā)病率和死亡率很高，給養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性打擊，同時危害人類生命安全[6]。本病主要為接觸傳染，水平傳播，其發(fā)病受季節(jié)的影響，但又不完全受季節(jié)的限制，熱冷應(yīng)激常常是誘發(fā)本病的重要因素[7]。

禽流感的臨床癥狀與病毒毒力、環(huán)境因素、并發(fā)感染有關(guān)，也與雞的品種、雞的年齡、雞的性別密切相關(guān)，因而其臨床表現(xiàn)是極不一致的[8]。雞群常突然發(fā)病。流行初期的急性病例可不出現(xiàn)任何癥狀而死亡。病雞表現(xiàn)精神沉郁，羽毛蓬亂，不愿走動；食欲減退或廢絕；眼瞼浮腫，冠、髯腫脹、青紫、出血、壞死；眼結(jié)膜充血，分泌物增多；鼻分泌物同時增多，常使病雞搖頭甩頸。病雞有不同程度的呼吸道癥狀，咳嗽、喇鼻，打噴嚏，有喘嗚音等。病雞出現(xiàn)或不出現(xiàn)下??；下痢者，以黃綠色、綠色稀便為主，稀便中常常伴有似血樣桔紅色條塊物(常被誤認為球蟲)，尿酸鹽增多。病雞腿鱗青紫或呈紫色，有出血點；皮膚常有出血斑點。有的病雞出現(xiàn)似神經(jīng)癥狀的驚厥現(xiàn)象。產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率明顯下降，蛋殼褪色，出現(xiàn)畸形蛋、軟皮蛋、砂殼蛋等，蛋殼表面膠質(zhì)層內(nèi)常出現(xiàn)大量干紅斑點，以薄殼蛋為主，極易破碎。

我國從2004年起，在全國開始對存欄的禽類進行強制免疫，是預(yù)防控制禽流感流行的重要舉措。在大面積集中免疫的情況下，由于候鳥和水禽在禽流感傳播中具有很重要的角色，而且病毒也不斷發(fā)生抗原飄移和抗原突變，其影響免疫的因素較多，免疫后抗體產(chǎn)生水平仍然需要進行監(jiān)測和分析，從而為以后的強制免疫工作和禽流感防治工作提供有益的參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 山東省家禽養(yǎng)殖場(戶)，主要是家養(yǎng)的雞、鴨(以商品代)為主，重點抽檢免疫21天后家禽，抽檢范圍為山東省17地市，規(guī)模場每場不少于20份樣品，散養(yǎng)戶數(shù)量不等，比例在10%～50%間，每個樣品采血量2ml，抽檢時間一般于末次免疫后21d。每次抽樣數(shù)量如下：2009年春季共采集禽血清樣品1792份，來自76個養(yǎng)雞場、14個養(yǎng)鴨場和3個養(yǎng)鵝場；2009年秋季共采集禽血清樣品1884份，來自72個養(yǎng)雞場、18個養(yǎng)鴨場和1個養(yǎng)鵝場；2010年春季共采集禽血清樣品1932份，來自80個養(yǎng)雞場和17個養(yǎng)鴨場；2010年秋季共采集禽血清樣品2098份，來自88個養(yǎng)雞場、16個養(yǎng)鴨場和2個養(yǎng)鵝場；2011年春季共采集禽血清樣品3100份，來自95個養(yǎng)雞場、17個養(yǎng)鴨場；2011年秋季共采集禽血清樣品3048份，來自88個養(yǎng)雞場、13個養(yǎng)鴨場和2個養(yǎng)鵝場。2012年春季共采集禽血清樣品2680份，來自85個養(yǎng)雞場、14個養(yǎng)鴨場；2012年秋季共采集禽血清樣品2841份，來自87個養(yǎng)雞場、13個養(yǎng)鴨場。2013年春季共采集禽血清樣品3805份，來自92個養(yǎng)雞場、15個養(yǎng)鴨場；2013年秋季共采集禽血清樣品3498份，來自87個養(yǎng)雞場、15個養(yǎng)鴨場。

1.1.2 主要試劑 雞紅細胞懸液、H5型禽流感抗原及陽性血清(由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，效價為l:2048)、疫苗(國內(nèi)某企業(yè)生產(chǎn)的H5亞型禽流感(Re-4+Re-5株)疫苗)。

1.1.3 主要耗材及儀器96孔“V”形微量反應(yīng)板、定量移液器(25μl)、滴頭、微型振蕩器、恒溫箱、離心機等。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 用血凝試驗(HA)檢測所購買的禽流感標準抗原的血凝價，然后制備4倍血凝價的抗原液，采用血凝抑制試驗(HI)檢測血清樣品中抗體的效價。血凝試驗，血凝抑制試驗均按照抑制試驗均按照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》(GB/T18936-2003)規(guī)定的微量法進行。

1.2.2 結(jié)果判定 以完全抑制4IU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。HI價小于或等于3log2判陰性；HI價等于4log2為可疑，進行重復(fù)試驗；H1價大于或等于5log2判陽性，判定為杭體合格。根據(jù)省、市動物疫病監(jiān)測方案規(guī)定，家禽免疫后21d進行免疫效果監(jiān)測，HI試驗免疫抗體大于或等于4log2的樣品判為合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年份抗體合格率

本研究自2009年起至2013年底山東省17地市家禽監(jiān)測情況進行統(tǒng)計，共采集樣品26678份，采用HI試驗進行了H5亞型禽流感Re-4株抗體和Re-5株抗體檢測，分別檢測有25959、25825份樣品合格，免疫合格率達到97.31%和96.80%。從時間上看，2009年春季、秋季和2010年春季Re-4株抗體檢測的免疫合格率在84.93%～89.60%，Re-5株抗體檢測的免疫合格率在83.20%～85.61%，二者均在90%以下；而2010年秋季、2011年春秋、2012年春秋、2013年春秋兩季抽測二者抗體的免疫合格率均達到了100%，見表1，圖1。

表1 2009-2013年山東省H5亞型禽流感抗體 (份、%)

圖1 2009-2013年不同時間山東省H5亞型禽流感抗體合格率

2.2 不同監(jiān)測場點抗體合體率比較

山東省家禽飼養(yǎng)以現(xiàn)代規(guī)模化養(yǎng)殖為主，但仍然存在農(nóng)村散養(yǎng)戶養(yǎng)殖情況。由于散養(yǎng)分布廣，散養(yǎng)戶預(yù)防免疫意識差，給疾病防控工作帶來很大難度，疫情風(fēng)險比較大，同樣是監(jiān)測防疫的重點對象。市場流通也是疾病防控的重要環(huán)節(jié)，同樣不能忽視。對2009年至2013年山東省規(guī)模戶、散養(yǎng)戶和市場三種不同的監(jiān)測場點進行監(jiān)測，抗體檢測結(jié)果見表2、圖2。

表2 2009-2013年山東省不同監(jiān)測場點H5亞型禽流感抗體(份、%)

從表2中可以看出不同養(yǎng)殖規(guī)模的Re-4和Re-5免疫后H5亞型禽流感免疫抗體合格率均達到了91%以上，平均值接近97%。其中種禽場合格率最高，免疫合格率均達到了98%以上；散養(yǎng)戶的免疫合格率則較低，只有92%左右。

圖2 2009-2013年山東省不同監(jiān)測場點H5亞型禽流感抗體合格率

由圖2可以看出，在種禽場和規(guī)?；唐穲鲋校槍e-4疫苗的抗體合格率要高于Re-5的抗體合格率，而在散養(yǎng)戶中，針對Re-5疫苗的抗體合格率則要高于Re-4的抗體合格率，說明在規(guī)模化養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶中使用的H5亞型禽流感疫苗的種類可能存在差異。

2.3 不同禽類抗體合體率

本研究共采集雞的血清樣品11794份，鴨的血清樣品1900份，鵝的血清樣品160份，對其進行抗體檢測后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，3種家禽體內(nèi)針對Re-4的抗體合格率按高低順序為雞(97.66%)、鴨(95.25%)、鵝(88.75%)，針對Re-5的抗體合格率按高低順序為雞(97.14%)、鴨(94.89%)、鵝(88.44%)；在3種家禽中，無論是針對Re-4的抗體合格率，還是針對為Re-5的抗體合格率，雞群免疫效果明顯好于鴨群，而鴨群的免疫效果又明顯好于鵝群，見表3、圖3。

從圖3可以看出，從免疫個雞、鴨、鵝三種家禽中，針對Re-4的抗體合格率均要稍高于針對Re-5的抗體合格率，顯示在2009～2013年間，山東省不同家禽體內(nèi)Re-4疫苗的免疫效果均要稍好于Re-5疫苗。

表3 2009-2013年山東省不同家禽H5亞型禽流感抗體 (份、%)

圖3 2009-2013年山東省不同家禽H5亞型禽流感抗體合格率

3 討論

（1）使用滅活疫苗免疫家禽以獲得針對高致病性禽流感的免疫保護是目前我國進行禽流感防控的主要措施。山東省是我國主要的養(yǎng)禽省份之一，多年來一直按照農(nóng)業(yè)部的部署認真落實禽流感的防疫工作。從本次進行的山東省H5亞型禽流感抗體檢測的結(jié)果來看，2009年春季、秋季和2010年春季Re-4株抗體檢測的免疫合格率在84.93%～89.60%，Re-5株抗體檢測的免疫合格率在83.20%～85.61%，二者均在90%以下；而2010年秋季、2011年春秋、2012年春秋、2013年春秋兩季抽測二者抗體的免疫合格率均達到了100%，表明山東省H5亞型禽流感的防疫效果呈逐年上升趨勢。（2）從監(jiān)測場點的檢測結(jié)果來看，種禽場、規(guī)模商品場和散養(yǎng)戶的樣品中規(guī)?；B(yǎng)殖場合格率較高，特別是種禽場的抗體水平最高，種雞場的合格率達到100%，種鴨場的合格率也明顯高于商品鴨場，這可能是由于種禽場在養(yǎng)禽業(yè)的上游，規(guī)模化程度和養(yǎng)殖水平明顯高于商品場和散養(yǎng)戶，而且，種禽場的禽多為多次免疫，免疫應(yīng)答也比免疫一兩次的商品代家禽的免疫效果好。

4 結(jié)論

（1）山東省近年來針對H5亞型禽流感的疫苗防疫工作落實到位，特別是2010年秋季之后，家禽血清抗體檢測合格率達到了100%。（2）在免疫合格率達不到100%時，種禽場的免疫合格率明顯高于商品化規(guī)模場，商品化規(guī)模場高于散養(yǎng)戶。

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S858.31

A

1007-1733(2014)09-0003-03

2014–06–13）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團隊項目資助，項目編號：SDAIT-13-011-17；種畜禽場疫病凈化技術(shù)示范與推廣項目。

*通訊作者