劉 悅，張京京，黃宇明，李 荷

（1.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.深圳市羅湖外語學(xué)校，廣東深圳 518004）

一株抗腫瘤活性的紅樹林細(xì)菌的篩選及鑒定

劉 悅1，張京京2，黃宇明1，李 荷1

（1.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.深圳市羅湖外語學(xué)校，廣東深圳 518004）

從深圳紅樹林土壤中分離出一株嗜鹽細(xì)菌S17，對其進(jìn)行生理生化特性研究并進(jìn)行潛在的抗菌和抗腫瘤活性評價，采用16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析方法對其進(jìn)行分子鑒定。研究結(jié)果表明：菌株S17為中度嗜鹽細(xì)菌，與短小芽孢桿菌屬Bacillus pumilus ATCC 7061具有99%同源性。S17的粗提物對多種細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞的生長都具有較強(qiáng)的抑制作用，可以進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)和利用。

紅樹林；中度嗜鹽細(xì)菌；抗菌活性；抗腫瘤活性

0 引言

隨著微生物來源的藥物需求量不斷增加，向海洋微生物尋求藥用物質(zhì)和藥物先導(dǎo)化合物已成為各國的研究重點［1－4］。紅樹林是熱帶、亞熱帶陸地與海洋潮間帶的木本植物群落，是一種比較特殊的森林生態(tài)系統(tǒng)，也是物種多樣性最豐富的生態(tài)系統(tǒng)之一，具有重要的生態(tài)地位。紅樹林區(qū)的微生物由于所處耐鹽、厭氧等特殊生境，遺傳及生理特性與其他生境中的微生物相比具有特異性，具有產(chǎn)生新型活性物質(zhì)的潛力，是開發(fā)新藥的重要資源［5－8］。目前，已經(jīng)從紅樹林土壤中篩選出多種有用物質(zhì)［9－11］。本研究主要是對從深圳福田紅樹林自然保護(hù)區(qū)土壤中分離純化到的Bacillus pumilus屬細(xì)菌S17進(jìn)行分離鑒定，研究其代謝產(chǎn)物的抗菌和抗腫瘤活性，以期作為新的生物活性物質(zhì)的來源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗樣品采集于深圳福田紅樹林自然保護(hù)區(qū)中紅樹林根泥，4℃保存，進(jìn)行后續(xù)的菌株篩選。

分離培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨5 g、牛肉膏2 g、酵母粉1.5 g、葡萄糖5 g、K2HPO40.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaCl 5 g、（NH4）2SO40.1 g、瓊脂15 g、pH7.0。

1.2 菌株的分離純化及生化鑒定

將采集土樣用無菌水進(jìn)行適當(dāng)稀釋成10－1～10－5梯度濃度，取100μL稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落平板劃線分離、純化菌種。觀察菌株的生長形態(tài)，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［12］和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［13］進(jìn)行常規(guī)生化鑒定。

1.3 菌株的耐鹽度特性測定

將篩選的菌株接種于不同鹽濃度的液體培養(yǎng)基中，NaCl終濃度（g／100 mL）分別為0%、1%、3%、5%、7%、9%、11%、15%，37℃，170 r／min恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3 d，測OD600，測定菌種生長濃度。

1.4 菌株的16S rDNA的序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

用SDS法提取細(xì)菌DNA，以通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1 492 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增16S rDNA基因。PCR產(chǎn)物用omega膠回收試劑盒進(jìn)行純化。純化后的菌種16S rDNA與pMD 18-T載體（Takara）進(jìn)行連接，將連接片段轉(zhuǎn)入經(jīng)CaCl2處理的Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，采用選擇性LB培養(yǎng)基平板（加氨芐青霉素、IPTG、X-gal）進(jìn)行陽性克隆子的篩選。提取白色陽性克隆單菌落的質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證后送測序，測序由華大基因完成。

測序結(jié)果與GenBank中已有的序列進(jìn)行BLAST對比。選擇相似性最大的即同源性比較高的菌株16S rDNA序列進(jìn)行序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用Clustal X1.83軟件進(jìn)行多序列比對，利用MEGA4.0繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。菌株S17的16S rDNA序列已經(jīng)提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中，序列號為KC778622。

1.5 抗菌及抗腫瘤活性的測定

利用平板劃線法得到細(xì)菌S17的單菌落，挑選一個單菌落接種到含有20 m L改良培養(yǎng)基中，37℃、175 r／min，培養(yǎng)12 h，將20 mL種子液接種到200 mL相同培養(yǎng)基中；同樣生長條件培養(yǎng)48 h，菌種發(fā)酵液離心（5 000 r／min，25℃，10 min），上清液用乙酸乙酯抽提3次，收集有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃減壓濃縮至適量，冷凍干燥，得發(fā)酵粗提取樣品；精密稱取適量該提取樣品，用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液溶解粗提取樣品至終濃度為10 mg／m L的樣品溶液，用于抗菌和抗腫瘤活性檢測，以80%的甲醇作空白對照溶液。

采用牛津杯法進(jìn)行抗菌活性的測定，以金黃色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和黑曲霉（Aspergillus niger）作為指示菌。根據(jù)抑菌圈的直徑定性判斷菌株的抗菌能力。

采用MTT法檢測嗜鹽細(xì)菌S17粗提物對人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，用新鮮DMEM高糖培養(yǎng)基配制成2×105個／m L的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔加細(xì)胞懸液200μL，37℃培養(yǎng)1 h后，每孔加樣品液或空白對照溶液各2μL，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)37℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加5 mg／m L的MTT溶液20μL，37℃孵育4 h，每孔加DMSO 150 μL，室溫充分振蕩10 min使MTT紫色產(chǎn)物完全溶解，測量570 nm處的吸光度（OD）。取OD平均值，以空白對照組為100%，按下式計算抑制率（IR%）：

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株S17的形態(tài)特征

菌株S17在分離培養(yǎng)基中生長狀況良好，如圖1所示，菌落表面色暗有褶皺，淡黃色，不規(guī)則形，不透明，革蘭氏染色顯示S17為革蘭氏陽性，菌體形態(tài)呈桿狀，很少成鏈。染色均勻，菌體大小為（0.6～0.7）μm×（2.0～3.0）μm。

2.2 菌株S17的生理特征

耐鹽度特性試驗結(jié)果見表1，由表1可看出：菌株S17在鹽濃度為0%～15%培養(yǎng)基中可以生長，生長最適鹽質(zhì)量濃度范圍為5%～11%，最適鹽質(zhì)量濃度為5%，在低鹽質(zhì)量濃度（＜5%）和高鹽質(zhì)量濃度（＞11%）培養(yǎng)基中生長相對緩慢，根據(jù)文獻(xiàn)中嗜鹽菌的分類，將其歸屬于中度嗜鹽菌［14］。

圖1 Bacillus sp.S17的菌落形態(tài)

表1 鹽度對菌株S17生長的影響

2.3 菌株S17的系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株S17的16S rDNA基因序列分析結(jié)果見圖2，它與短小芽孢桿菌Bacillus pumilus ATCC 7061（NR_043242）聚類為一支，它們的16S rDNA序列相似性高達(dá)99%，判斷S17與Bacillus pumilus最接近，可以初步確定菌株S17屬于芽桿菌屬。

圖2 中度耐鹽菌S17及其相關(guān)屬種的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 抗菌活性篩選結(jié)果

表2為細(xì)菌S17的抗菌性篩選結(jié)果，由表2可知：菌株S17的粗提物對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌和絲狀真菌黑曲霉均有明顯抗菌活性，而對革蘭氏陰性菌大腸桿菌無抗菌活性?？梢姡闟17的粗提物的抗菌活性以抗革蘭氏陽性菌為主，對指示菌的抑制強(qiáng)度表現(xiàn)為革蘭氏陽性菌＞革蘭氏陰性菌＞絲狀真菌，其中S17抑制金黃色葡萄球菌的能力最強(qiáng)，抑菌圈為10.1 mm。

用MTT法檢測細(xì)菌S17發(fā)酵粗提物的細(xì)胞毒活性，測得3個復(fù)孔OD570值分別為：OD1＝1.271，OD2＝1.258，OD3＝1.352，RSD＝0.051，因此，OD樣品＝1.294±0.051，OD空白＝2.703±0.024，其IR為52.2%。結(jié)果表明：其粗提物對人肝癌細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，而陰性空白對照對人肝癌細(xì)胞HepG2未顯示細(xì)胞毒性作用。

表2 細(xì)菌S17的抗菌活性篩選結(jié)果

3 討論

本研究篩選分離出的嗜鹽菌S17最適鹽質(zhì)量濃度范圍為5%～11%，，根據(jù)嗜鹽菌的分類，中度嗜鹽菌最適生長鹽質(zhì)量濃度3%～15%（0.5～2.5 mol／L），因此屬于中度嗜鹽菌。已有的研究結(jié)果表明，中度嗜鹽菌有著重要的研究價值和廣闊的應(yīng)用前景，對其研究主要是集中在對其產(chǎn)生的酶、一些功能性分子和大分子多聚物以及生物環(huán)保等方面。普通酶在高鹽條件下會變性失活，而嗜鹽菌產(chǎn)生的酶在高鹽條件下仍能保持較高的活性和穩(wěn)定性，更能適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)條件的需要，因而具有極高的應(yīng)用潛能。文獻(xiàn)［15］從煙臺海域也分離篩選出一株中度嗜鹽芽孢桿菌YTM-5，最適宜的生長條件為3%鹽質(zhì)量濃度，本研究篩選出的S17最適生長條件為5%鹽質(zhì)量濃度，相比較而言，S17更加耐鹽，從而也更能滿足工業(yè)應(yīng)用的需要。

通過對菌株S17生理特性的研究和16S rDNA序列的比對，確定其為Bacillus pum ilus屬的中度嗜鹽菌，進(jìn)一步研究了其對多種指示菌的抗菌活性及對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，將其應(yīng)用于藥用活性物質(zhì)的篩選。研究結(jié)果顯示：菌株S17對以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性菌和以黑曲霉為代表的絲狀真菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用，并對人肝癌細(xì)胞HepG2有很強(qiáng)的抑制作用，可以作為發(fā)現(xiàn)新型生物活性物質(zhì)的潛在資源。近幾年研究人員已經(jīng)從多種生境中分離到一批具有抗菌、抗腫瘤的細(xì)菌和真菌。比如，文獻(xiàn)［16］從北極的沉積物中篩選出一株嗜冷細(xì)菌，以人胃癌細(xì)胞MGC80-3為測試細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵液有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。文獻(xiàn)［17］對100株深海真菌進(jìn)行了抗腫瘤及抗菌活性檢測，發(fā)現(xiàn)深海真菌具有良好的生物活性，細(xì)胞毒性陽性率占49%，26%的菌株具有明顯抗大腸桿菌效果，23%抗枯草芽孢桿菌，5%抗白假絲酵母，21%抗金黃色葡萄球菌。這一系列的研究都表明，從微生物資源中探尋新型抗生素和抗腫瘤藥物是一種行之有效的途徑，本研究也為后期開發(fā)新藥提供了研究基礎(chǔ)。

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Q7

A

1672－6871（2014）01－0071－04

國家自然科學(xué)基金項目（30970107）；廣東省科技廳基金項目（2012B01030002）

劉 悅（1987－），女，安徽阜陽人，碩士生；李 荷（1968－），女，黑龍江綏化人，為通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物分子生物學(xué)的研究.

2013－04－12