余祖華，丁 軻，滕 蔓，宿靖偉，羅 俊

（1.河南科技大學(xué)動物疫病與公共安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽 471003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院a.農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.河南省動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002）

河南商品蛋雞群馬立克氏病病毒流行株的分離與鑒定

余祖華1，2a，2b，丁 軻1，滕 蔓2a，2b，宿靖偉2a，2b，羅 俊2a，2b

（1.河南科技大學(xué)動物疫病與公共安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽 471003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院a.農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.河南省動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002）

2011年～2012年，河南省多個地區(qū)養(yǎng)殖場雞群爆發(fā)了馬立克氏病，應(yīng)用外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)對流行毒株分離并進(jìn)行了PCR鑒定，最終分離到17個馬立克氏病毒毒株，這些病毒株感染雞胚成纖維細(xì)胞3～5 d后均能形成典型的病毒蝕斑，從感染細(xì)胞總DNA中均能擴(kuò)增出132 bp重復(fù)序列的特異性條帶，且各毒株間132 bp重復(fù)序列擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)存在明顯差異，分離鑒定表明：河南雞群中可能存在不同毒力馬立克氏病毒野毒株的共流行。

馬立克氏病病毒；分離；鑒定；132 bp重復(fù)序列

0 引言

馬立克氏病（MD）是由馬立克氏病毒（MDV）感染雞引起的一種以淋巴細(xì)胞增生為特征的腫瘤性免疫抑制性傳染?。?］。MDV屬于α皰疹病毒，具有嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合性［2－3］。MDV有3個血清型，血清型Ⅰ（MDV-1）、Ⅱ型（MDV-2）和Ⅲ型（MDV-3），其中，只有MDV-1具有致病性或致瘤性，包括對宿主具有毒力或致瘤性的強(qiáng)毒分離株以及它們的致弱變異株。根據(jù)致病性的不同，MDV-1野毒分離株又可以分為溫和MDV（m MDV）、強(qiáng)毒MDV（v MDV）、超強(qiáng)毒MDV（vv MDV）以及超超強(qiáng)毒MDV（vv＋MDV）［4－5］。MDV基因組全長約180 kb，主要由一個長獨(dú)特序列區(qū)（UL）和一個短獨(dú)特序列區(qū)（US）構(gòu)成，在獨(dú)特序列區(qū)兩側(cè)分別是兩個序列完全相同的反轉(zhuǎn)重復(fù)序列區(qū)，長末端重復(fù)序列（TRL）和長內(nèi)部重復(fù)序列（IRL）或是短末端重復(fù)序列（TRS）和短內(nèi)部重復(fù)序列（IRS）［6－8］，MDV特異性的病毒基因主要位于反轉(zhuǎn)重復(fù)序列區(qū)TR／IR中［9］，其中，132 bp重復(fù)序列、meq基因和pp38基因等與MDV致腫瘤相關(guān)［10］。MD是一種可以用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防的腫瘤性疾病，疫苗株主要有MDV-1的CVI988／Rispens株和國內(nèi)的814株、MDV-2的SB1株及MDV-3的FC-126株，這些疫苗株在MDV的防控中發(fā)揮了重要的作用。雖然疫苗的應(yīng)用能較好地預(yù)防MDV的發(fā)生，但由于MDV毒力在不斷的增強(qiáng)，近年來在國內(nèi)外疫苗免疫雞群中仍不斷有MD的發(fā)生，給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［11－13］。2011年～2012年，中原地區(qū)較大面積的疫苗免疫雞群也發(fā)生了疑似MDV的病例［14］，本文從這些發(fā)病雞中分離了一些毒株，并通過對132 bp重復(fù)序列的PCR擴(kuò)增進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)河南省雞群中可能流行著不同毒力的MDV。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料：采集自河南省6地區(qū)MD疑似病例雞場［14］。

1.1.2 無特定病原體（SPF）雞胚：購于濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

1.1.3 毒株：GX0101 vv MDV株，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院崔治中教授饋贈。

1.1.4 試劑：Premix Ex TaqTM、Universal Genom ic DNA Extraction Kit Ver.3.0，均購自寶生物工程（大連）有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.5 引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank中發(fā)表的MDV Md5株基因組序列（No.AF243438），用Primer primer5.0軟件設(shè)計(jì)了一對擴(kuò)增132 bp重復(fù)序列引物，正向引物為P1：5’-ATGCGATGAAAGTGCTATGGAGGAA-3’，位于基因組129 048～129 072堿基處，反向引物為P2：5’-ATCGAAAGCGTTACCGAACTTGTCT-3’位于基因組129 371～129 395堿基處，設(shè)計(jì)的引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 雞胚成纖維細(xì)胞的制備：取孵化至9日齡的SPF雞胚，按常規(guī)方法制備單層雞胚成纖維細(xì)胞。

1.2.2 病毒的分離：從疑似發(fā)生MD的病例雞翼下采集1 mL抗凝血與9 mL含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混勻，于1 000 r／mim離心5 min，將上層的白細(xì)胞混懸液接種到12孔板中長滿單層的CEF上，每樣3個重復(fù)，置CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)5～6 d后，消化單層細(xì)胞盲傳至6孔板中長滿單層的CEF上，然后再盲傳至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至病毒蝕斑出現(xiàn)。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)典型的蝕斑后按照常規(guī)方法收集凍存細(xì)胞，于液氮中凍存。

1.2.3 病毒感染細(xì)胞總DNA的提?。喊凑誙niversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0操作手冊提取細(xì)胞總DNA，NanoDrop ND-1000（NanoDrop公司，美國）測定提取的DNA的濃度及純度，并用去離子水將提取的DNA調(diào)整至濃度為100 ng／μL，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 132 bp重復(fù)序列的PCR擴(kuò)增：用提取的感染細(xì)胞總DNA為模板進(jìn)行132 bp重復(fù)序列的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20μL，包括ExTaq酶10μL，10 pmol／μL的P1、P2各lμL，DNA模板1μL，ddH2O 7μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 m in，94℃變性1 min，62℃復(fù)性1 min，72℃延伸3 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min后置4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%（質(zhì)量體積比）瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下分析電泳條帶。

圖1 MDV分離株在CEF上形成的蝕斑

2 結(jié)果

2.1 MDV分離培養(yǎng)結(jié)果

采集MD疑似病例雞的外周血，在CEF單層細(xì)胞上進(jìn)行MDV的分離培養(yǎng)。經(jīng)過3～8代的連續(xù)多次細(xì)胞盲傳代，從河南光山、上蔡、漯河、欒川、新鄭等地MDV疫苗免疫的產(chǎn)蛋雞群，約40份患病雞外周血樣本中共計(jì)獲得17個MDV分離株，分別命名為HNGS101、HNGS201、HNGS206、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC107、HNLC202、HNLC203、HNLC401、HNLC502、HNLC503、HNLH302、HNLH303、HNLH304、HNLH305和HNSC105（見表1），分離率為42.5%。這些分離株在CEF上經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，均能較好的適應(yīng)CEF，并在接種CEF細(xì)胞單層后3～5 d形成典型的病毒蝕斑（如圖1所示）。

表1 MDV河南分離株的部分背景信息

2.2 MDV132-bp重復(fù)序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果

對17個MDV分離株的132-bp重復(fù)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)：分離株HNGS101、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC502、HNLH302、HNLH303、HNLH305和HNSC105與對照毒株GX0101一樣，均能擴(kuò)增出與預(yù)期相符的2個132-bp拷貝大小的產(chǎn)物，分離株HNLC107、HNLC202、HNLC203和HNLC401擴(kuò)增出與3個132-bp拷貝大小相符的PCR產(chǎn)物，從分離株HNGS206擴(kuò)增出的132-bp產(chǎn)物約有4個拷貝，而分離株HNGS201、HNLC503和HNLH304的132 bp擴(kuò)增產(chǎn)物至少含有7拷貝以上的132 bp重復(fù)序列（見圖2）。

圖2 132 bp重復(fù)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

3 討論

MDV的分離，通常是將羽囊液上清經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離的外周血或脾臟的淋巴細(xì)胞接種至鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）或CEF上進(jìn)行培養(yǎng)［13，15］，本研究直接將抗凝血低速離心去除紅細(xì)胞后將上層的白細(xì)胞混懸液接種至CEF上，也能分離出MDV，分離率高達(dá)42.5%，說明這種方法用于MDV的分離培養(yǎng)效果良好。132 bp重復(fù)序列是MDV-1所特有的基因序列，主要位于MDV基因組的長重復(fù)序列區(qū)。本研究分離的毒株應(yīng)用132 bp基因的特異性引物均能擴(kuò)增出特異性條帶，這表明分離的17株毒株均是MDV-1型毒株。本研究分離的MDV均來源于CVl988／Rispens株疫苗免疫雞群，這表明在中國中原地區(qū)也廣泛流行著MDV野毒株，且其致病力能突破疫苗免疫保護(hù)力，能造成雞群腫瘤發(fā)生。此前研究表明：132 bp的拷貝數(shù)可以作為初步判斷MDV非致瘤株、減毒株、弱毒株與強(qiáng)毒株的參考，毒力較強(qiáng)的MDV基因組中通常含有2～3個拷貝數(shù)的132 bp重復(fù)序列，而致弱毒株中則含有更高的拷貝數(shù)［16］。理論上而言，用設(shè)計(jì)的132 bp重復(fù)序列特異性引物擴(kuò)增后，2拷貝的132 bp產(chǎn)物預(yù)計(jì)大小為348 bp，3拷貝的132 bp產(chǎn)物大小為480 bp，依此類推，7拷貝132 bp產(chǎn)物大小為1 008 bp。本研究中，分離株HNGS101、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC502、HNLH302、HNLH303、HNLH305和HNSC105的132 bp重復(fù)序列拷貝數(shù)與分離自廣西雞群的vv MDV毒株GX0101的拷貝數(shù)相同，均為2個拷貝，而分離株HNLC107、HNLC202、HNLC203和HNLC401含有3個拷貝的132 bp重復(fù)序列，表明這些毒株可能是強(qiáng)毒株。MDV在細(xì)胞培養(yǎng)中連續(xù)傳代會增加132 bp重復(fù)序列的拷貝數(shù)［17］。文獻(xiàn)［18］研究表明：當(dāng)MDV在細(xì)胞培養(yǎng)物中連續(xù)傳代75代后132 bp重復(fù)序列的拷貝數(shù)明顯增加到10個拷貝以上，這表明伴隨著MDV的毒力減弱132 bp重復(fù)序列的拷貝數(shù)會明顯增加。本文分離的HNGS201、HNLC503和HNLH304至少含有7拷貝的132 bp重復(fù)序列，但這些毒株的分離僅僅經(jīng)歷了3～4代，表明這幾個分離株的132 bp重復(fù)序列的拷貝數(shù)不是由于連續(xù)傳代所致，可能這些分離株本身就屬于弱毒分離株或疫苗株，因此，這些分離株的確切毒力或致病性還有待進(jìn)一步研究。

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S852.65；Q78

A

1672－6871（2014）01－0067－04

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31072145，31372445）

余祖華（1977－），女，河南商城人，講師，博士，主要從事動物傳染病與免疫學(xué)研究.

2013－09－11