王瑩瑩,劉偉杰,杜鋼軍

(河南大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所,河南開(kāi)封475004)

皂角刺抗腫瘤的初步研究

王瑩瑩,劉偉杰,杜鋼軍*

(河南大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所,河南開(kāi)封475004)

目的 觀察皂角刺水煎液的體內(nèi)外抗腫瘤作用。方法 體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立小鼠背部皮下移植性實(shí)體腫瘤H22荷瘤動(dòng)物模型,灌胃給藥后測(cè)定腫瘤體積、質(zhì)量及免疫器官指數(shù);體外實(shí)驗(yàn):用MTT法測(cè)定皂角刺對(duì)小鼠lewis肺癌細(xì)胞的影響。結(jié)果 體內(nèi)實(shí)驗(yàn):在本實(shí)驗(yàn)劑量下(0.3 m L/g),與模型對(duì)照組比較,皂角刺組腫瘤生長(zhǎng)減緩,抑瘤率為38.37%,胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均增高;體外實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)所用濃度的皂角刺水煎液呈劑量依賴性抑制小鼠lewis肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)論 皂角刺有一定抗腫瘤作用,其機(jī)制可能與細(xì)胞毒和提高機(jī)體免疫作用有關(guān)。

皂角刺;H22;lewis;MTT

近年來(lái),在世界范圍內(nèi),幾乎所有的腫瘤發(fā)生率都呈上升趨勢(shì)。中藥在改善腫瘤患者體質(zhì)、降低化療藥物的毒性、增強(qiáng)化療藥物的療效方面獨(dú)具特色[1]。中藥及其復(fù)方制劑由于多種活性成分并存,通過(guò)多種途徑、多個(gè)靶點(diǎn)、多種方式在腫瘤的治療中發(fā)揮作用,因此,更引人注目。皂角刺,又稱(chēng)皂角針,是豆科皂莢屬植物皂莢(Gleditsia sinensis Lam)的干燥棘刺,主要產(chǎn)于河南、江蘇、湖北等地,全年均可采收,民間及臨床應(yīng)用歷史悠久,具有廣泛的藥用價(jià)值。皂角刺是一種傳統(tǒng)中草藥,具有調(diào)節(jié)免疫、抗凝血、抗癌等功效。本品味辛,性溫,專(zhuān)功消腫排膿,中醫(yī)臨床用于癰疽、腫毒,均有較好的治療效果,一般表現(xiàn)為膿未成者可消,膿已成者可使之速潰[2]。中藥皂角刺中含有多種皂苷、黃酮、三萜等黃酮類(lèi)[3]生物活性成分,作用廣泛。

目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)皂角刺抗腫瘤活性的研究報(bào)道相對(duì)較少。我們認(rèn)為,皂角刺在抗體表腫瘤方面有增效的作用。本實(shí)驗(yàn)采用H22肝癌細(xì)胞皮下移植動(dòng)物模型評(píng)價(jià)皂角刺的體內(nèi)抗腫瘤作用,以期為皂角刺用于腫瘤治療提供有價(jià)值的資料,為藥用植物應(yīng)用于抗腫瘤理論加以補(bǔ)充,更為了指導(dǎo)臨床正確使用皂角刺對(duì)腫瘤的治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,皂角刺能使小鼠體表腫瘤逐漸縮小,從而延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存時(shí)間,阻止小鼠腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移,對(duì)小鼠體表腫瘤有確切的治療作用。以下是我們對(duì)皂角刺抗腫瘤作用的初步研究。

1 材料

1.1 藥品

中藥皂角刺:皂角刺150 g與適量水煎煮30 min (煮沸后,轉(zhuǎn)文火后開(kāi)始計(jì)時(shí))以上,重復(fù)煎煮3次,收集齊3次水煎液,靜置后,取上清液濃縮至80 m L左右,移至瓶中,置于冰箱,4℃保存,供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用。無(wú)菌過(guò)濾濾液,供細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)GIBCO公司);胰酶(美國(guó)GIBCO公司);MTT(美國(guó)Sigma公司);DMSO(鄭州派尼化學(xué)試劑廠);生理鹽水等。

1.3 動(dòng)物與瘤株

昆明小鼠,雌性,22～25 g,河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):豫動(dòng)合字101號(hào));H22肝癌,本實(shí)驗(yàn)室于昆明小鼠在體傳代保存;lewis肺癌細(xì)胞,河南大學(xué)藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)提供。

1.4 儀器

HDL潔凈臺(tái) (北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);快速混勻器SK-1(常州國(guó)華電器有限公司); El X800酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-IEK公司);TDL-508臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);YN-ZD-2電熱蒸餾水器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);CHA-S恒溫振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司); BD-400冰柜(河南冷柜廠);電子天平(上海精密儀器有限公司)。

2 方法

2.1 對(duì)H22小鼠肝癌皮下移植腫瘤的影響

取荷生長(zhǎng)良好的腹水型肝癌昆明小鼠處死,取腹水,加無(wú)菌生理鹽水稀釋至原腹水的6～8倍,使成5×106個(gè)細(xì)胞/m L的稀釋液。于20只狀態(tài)良好的小鼠后肢右背部皮下接種0.2 m L/只。將接種后的小鼠按體質(zhì)量平均分為模型組和皂角刺組,每組10只。其中模型組:灌胃清水0.3 m L/10 g;皂角刺組:灌胃皂角刺水煎液0.3 m L/10 g。方法均為每天早晚各1次,每次給藥間隔8 h以上。腫瘤接種后即日開(kāi)始給藥,連續(xù)灌胃3周。

治療期間,2 d監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量1次,待腫瘤長(zhǎng)出后用游標(biāo)卡尺每隔2 d測(cè)腫瘤長(zhǎng)和寬1次,腫瘤體積按下列公式計(jì)算:

腫瘤體積(mm3)=腫瘤長(zhǎng)度×腫瘤寬度×腫瘤寬度/2。

全程治療結(jié)束后次日處死小鼠,眼球取血,剝離背部腫瘤、肝臟、脾臟和胸腺,并稱(chēng)重。計(jì)算腫瘤抑制率及肝臟、胸腺、脾臟指數(shù)。同時(shí),觀察小鼠肺部等其他臟器是否正常。

臟器指數(shù)%=內(nèi)臟器官質(zhì)量(mg)/處死當(dāng)日體質(zhì)量(g)×100;腫瘤抑瘤率(%)=(1-T/C)× 100%。

式中:C為模型組平均瘤質(zhì)量(g);T為皂角刺組平均瘤質(zhì)量(g)。

2.2 對(duì)lewis肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

取lewis肺癌傳代細(xì)胞,加3 m L胰酶消化,振蕩搖勻,加入2 m L培養(yǎng)基以中和胰酶,離心2次,棄去上清液,加入培養(yǎng)基吹打均勻,在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度,吹打成單細(xì)胞懸液,備用。上述細(xì)胞點(diǎn)入96孔培養(yǎng)板,每孔100μL,另設(shè)置空白對(duì)照組及4個(gè)濃度梯度給藥組(藥物用培養(yǎng)基稀釋),每組設(shè)置4個(gè)平行對(duì)照孔,分別加入空白培養(yǎng)基100μL,50倍稀釋藥物100μL,100倍稀釋藥物100μL,200倍稀釋藥物100μL,400倍稀釋藥物100μL,置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)48 h,棄去藥物,加入5 g/L的MTT 100μL/孔,放置4 h后,加入DMSO 100μL/孔,置于酶標(biāo)儀于570 nm測(cè)OD值,計(jì)算抑制率。

腫瘤抑制率(%)=(1-給藥組OD值/模型組OD值)×100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠體質(zhì)量、腫瘤及免疫器官的影響

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組小鼠相比較,P≥0.05,給藥組的體質(zhì)量未見(jiàn)顯著性差異,見(jiàn)圖1;給藥組的腫瘤生長(zhǎng)速度較慢,見(jiàn)圖2;小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)較好,且給藥組小鼠的存活率亦未見(jiàn)顯著差異,見(jiàn)圖3。腫瘤逐漸化膿潰爛縮小,皂角刺對(duì)荷瘤小鼠H22肝癌有一定的抑制作用,抑瘤率為38.37%,免疫器官指數(shù)有所提高,見(jiàn)表1。

3.2 皂角刺對(duì)小鼠lewis肺癌的抑制作用

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨藥物濃度的改變抑制率也有所改變,藥物濃度升高,則抑制率升高,當(dāng)抑制率升高至200 mg/L濃度時(shí),對(duì)癌細(xì)胞抑制作用最強(qiáng),見(jiàn)表2。

圖1 H22荷瘤小鼠體質(zhì)量生長(zhǎng)曲線

圖2 H22荷瘤小鼠腫瘤體積生長(zhǎng)曲線

圖3 H22荷瘤小鼠存活曲線

表1 皂角刺對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官及瘤質(zhì)量的影響(±s,n=10)

表1 皂角刺對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官及瘤質(zhì)量的影響(±s,n=10)

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.05。

組別 劑量/(m L/10 g) 瘤質(zhì)量/(g) 胸腺指數(shù)/(mg/g) 脾臟指數(shù)/(mg/g) 肝臟指數(shù)/(mg/g)模型組 - 2.08±0.67 0.59±0.52 6.49±1.63 61.48±8.81皂角刺組 0.2 1.28±1.16*1.20±0.88*8.13±1.76*58.91±5.19

表2 皂角刺對(duì)lewis肺癌細(xì)胞的抑制率

4 討論

近代藥理研究表明,皂角刺具有消腫、脫毒、排膿、殺蟲(chóng)、抗菌、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗凝血和抗癌等藥理活性[2],皂角刺含有黃酮、皂莢皂苷、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、氨基酸、亞甾醇、谷甾醇、二十九碳烷、酚類(lèi)等,其中的抗腫瘤活性成分主要有皂苷、黃酮、酚類(lèi)和氨基酸等,能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲等。黃酮類(lèi)化合物是較早發(fā)現(xiàn)的具有較好抗腫瘤作用的物質(zhì),研究皂角刺總黃酮的抗腫瘤特點(diǎn)和潛在的作用機(jī)制對(duì)于理解皂角刺的抗腫瘤作用及從中發(fā)現(xiàn)新型抗腫瘤藥物均有重要意義[4-5]。

中藥的抑瘤率大于30%,并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異時(shí),可繼續(xù)實(shí)驗(yàn),連續(xù)3次實(shí)驗(yàn),療效穩(wěn)定,則評(píng)價(jià)此藥有一定的療效[6]。本次實(shí)驗(yàn)抑瘤率為38.37%,顯示皂角刺對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

長(zhǎng)期以來(lái),人們一直認(rèn)為機(jī)體的免疫系統(tǒng)在腫瘤演進(jìn)的過(guò)程中能夠清除腫瘤、保護(hù)自身,隨著研究的逐步加深越來(lái)越多的證據(jù)表明,腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞不但不能發(fā)揮抗腫瘤作用,反而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲與轉(zhuǎn)移[7]。而免疫系統(tǒng)功能正常與否與腫瘤治療成敗有著重要的關(guān)系,免疫治療本身也是現(xiàn)代腫瘤治療的一個(gè)重要組成部分。本次實(shí)驗(yàn)中,皂角刺組的肝指數(shù)稍微下降,免疫器官指數(shù)有所提高,脾淋巴細(xì)胞有增殖作用,提示皂角刺有一定抗腫瘤作用,并能增強(qiáng)機(jī)體發(fā)揮免疫作用,其潛在抗腫瘤作用可能是通過(guò)提高免疫作用實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,皂角刺有一定的抗腫瘤作用,也有潛在促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能,對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用,但在腫瘤治療應(yīng)用中需注意應(yīng)用方式。促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖提高免疫力[8],需要進(jìn)一步研究該藥的用量,進(jìn)而為腫瘤的治療提供有利條件。另外,皂角刺是否對(duì)部分腫瘤可表現(xiàn)為直接抑制作用有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

[1]Paraparesis K T,Kalemi T G,Zambouli D,et al.Synergistic effects of protein tyrosine kinase inhibitor genistein with camptothecins against three cell lines in vitro[J]. Cancer Lett,2006,233(2):255—256.

[2]張德發(fā),楊曉嬌.淺談中醫(yī)藥治療腫瘤的作用與機(jī)制[J].求醫(yī)問(wèn)藥,2012,10(9):60-61.

[3]劉明華,黃興武,肖順漢,等.皂角刺提取物對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及細(xì)胞因子的影響[J].腫瘤防治研究,2009,11 (36):365-367.

[4]陳海霞.皂角刺抗腫瘤作用有效成分研究進(jìn)展[J].四川生理科學(xué)雜志,2010,32(1):35-37.

[5]徐哲,陳曉輝,王漪檬,等.皂角刺抗腫瘤活性成分的分離鑒定與活性測(cè)定[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,25(2): 108-111.

[6]杜鋼軍,時(shí)小燕.治療癌癥的新途徑:靶向腫瘤微環(huán)境[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志,2011,38(5).336-340.

[7]蔣志平,彭騫,何周康.皂角刺的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].兒科藥學(xué)雜志,2008,14(5):57-59.

[8]陳紅,張建華,許曉群,等.蘇木精染色法測(cè)定化療藥物對(duì)貼壁腫瘤細(xì)胞毒性作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華腫瘤防治雜志,2010,17(11):374-375.

[責(zé)任編輯 時(shí) 紅]

Preliminary study of Spina Gleditsiae on anti-tumor

WANG Yingying，LIU Weijie，DU Gangjun*
（Institute of Pharmacy，Pharmaceutical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

Objective To observe antitumor effects of spina gleditsiae water extract in vitro and in vivo.Methods In vivo：the subcutaneous model of H22 liver cancer was established to observe antitumor by measuring the volume，weight of in situ tumor and immune organs index after ig of spina gleditsiae water extract.In vitro：MTT assay is used to test antitumor effects of spina gleditsiae water extract on lewis lung cancer cells.Results In vivo：compared with model control group，the tumor size in spina gleditsiae group was smaller，the inhibitionory rate was 38.37%，at the same time，the thymus index and spleen index increased.In vitro：spina gleditsiae water extract inhibited proliferation in a concentration dependent matter.Conclusion Spina gleditsiae have antitumor activity，its mechanism might be related to cytotoxity and immune modulation.

Spina Gleditsiae；H22；lewis；MTT

R285.5

A

1672-7606(2014)02-0088-03

2013-09-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173094);河南省高校青年骨干教師項(xiàng)目(2010GGJS-025);河南省科技廳重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(112101310308);河南大學(xué)省部共建項(xiàng)目(SBGJ090704)。

王瑩瑩(1986-),女,河南商丘人,碩士研究生,從事中藥抗腫瘤藥理學(xué)研究工作。

*通訊作者:杜鋼軍(1971-),男,博士,教授,博士,從事中藥抗腫瘤藥理學(xué)的研究工作。