戚笑笑,李 紅,杜鋼軍

(河南大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所,河南開封475004)

天南星抗腫瘤的初步研究

戚笑笑,李 紅,杜鋼軍*

(河南大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所,河南開封475004)

目的 觀察天南星的抗腫瘤作用。方法 體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立小鼠H22肝癌皮下移植模型,灌胃給予天南星粉,2次/d,監(jiān)測小鼠體質(zhì)量,檢測腫瘤體積、質(zhì)量以及免疫器官指數(shù),評(píng)價(jià)天南星對腫瘤生長的影響;體外實(shí)驗(yàn):采用MTT法測定天南星水煎液對lewis肺癌細(xì)胞生長的影響。結(jié)果 體內(nèi)試驗(yàn):在本實(shí)驗(yàn)劑量下(100 g/L),與對照組比較,天南星灌胃可使腫瘤生長減慢,抑瘤率為34.7%,給藥期間不影響小鼠生長狀態(tài),胸腺指數(shù)和肝臟指數(shù)略微降低,脾臟指數(shù)升高;體外實(shí)驗(yàn):天南星水煎液在實(shí)驗(yàn)劑量下對lewis肺癌細(xì)胞生長無影響。結(jié)論 天南星有抗腫瘤作用,其抗腫瘤作用不是直接細(xì)胞毒作用。

天南星;MTT;H22;Lewis

中藥作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié),其抗腫瘤活性是近年來研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)植物天南星具有悠久的藥用歷史,其含有生物堿、甾醇類、有機(jī)酸等有效成分[1],具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗腫瘤、抗心律失常等多種藥理作用。隨著對天南星化學(xué)成分的深入研究,其在抗腫瘤作用方面的研究也已成為新的研究熱點(diǎn)[2-3]。曾紹賢等[4]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含天南星的復(fù)方三生注射液對小鼠lewis肺癌、肝癌、艾氏腹水癌等多種移植性腫瘤有抑制作用,對體外培養(yǎng)人胃癌、肺癌及肝癌細(xì)胞有殺傷和抑制作用。本實(shí)驗(yàn)采用H22肝癌細(xì)胞皮下移植動(dòng)物模型評(píng)價(jià)天南星的體內(nèi)抗腫瘤作用,并考察其對lewis肺癌生長的影響,以期為天南星腫瘤治療提供有價(jià)值的資料,為藥用植物應(yīng)用于抗腫瘤理論加以補(bǔ)充,為臨床研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品

天南星水提物:稱取天南星100 g,加干凈自來水,水面以高于藥物3～5 cm為準(zhǔn),共煎煮3次,每次煎煮30 min(煮沸后,轉(zhuǎn)文火后開始計(jì)時(shí)),收集3次天南星水煎液,濃縮至200 m L,移至瓶中,無菌過濾,置冰箱內(nèi)4℃保存,供體外實(shí)驗(yàn)使用。

天南星混懸液∶天南星100 g加生姜煮沸祛毒后烘干打粉。取一定量藥粉,用體積分?jǐn)?shù)0.5%CMC-Na配制成100 g/L的混懸液,供體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2 試劑

D-Hanks緩沖液(本實(shí)驗(yàn)室配制);Tris-NH4CL (本實(shí)驗(yàn)室配制);體積分?jǐn)?shù)為0.5%CMC-Na(本實(shí)驗(yàn)室配制);DMEM培養(yǎng)基(購自Gibco公司);PBS(本實(shí)驗(yàn)室配制);胰酶(購自Hyclone公司);MTT(購自Sigma公司)。

1.3 動(dòng)物與瘤株

昆明小鼠,雌性,20±2 g,河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):豫動(dòng)合字101號(hào));H22肝癌,本實(shí)驗(yàn)室于昆明小鼠腹水傳代保存;lewis肺癌細(xì)胞,河南大學(xué)藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 儀器

HDL潔凈臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);El X800酶標(biāo)儀(美國BIO-IEK公司);TDL-508臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);YN-ZD-2電熱蒸餾水器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠); LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);CHA-S恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司);BD-400冰柜(河南冷柜廠);電子天平FA1004N (上海精密儀器有限公司);ZXC紫外消毒車(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械)。

2 方法

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對小鼠H22肝癌皮下移植腫瘤的影響

將接種10 d左右生長良好的H22小鼠腹水稀釋成5×106個(gè)細(xì)胞/m L,以0.2 m L/只接種于狀態(tài)良好的昆明小鼠右腋部皮下,建立H22肝癌皮下移植模型。接種后將小鼠按體質(zhì)量分為2組,每組10只。模型組:灌胃CMC-Na;天南星組:灌胃100 g/L天南星混懸液。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天開始以0.2 m L/10 g給藥,隔天監(jiān)測小鼠體質(zhì)量1次,早晚給藥各1次,給藥間隔為8 h,連續(xù)17 d。

腫瘤長出后,開始用游標(biāo)卡尺每隔l d測腫瘤長與寬1次,計(jì)算瘤體積。腫瘤體積(mm3)=腫瘤長度×腫瘤寬度×腫瘤寬度/2。

全程治療結(jié)束后剝離腫瘤、肝臟、脾臟和胸腺,并稱重,計(jì)算腫瘤抑制率及肝臟、胸腺、脾臟指數(shù),同時(shí),觀察小鼠肺部等其他臟器是否正常。臟器指數(shù)(%) =內(nèi)臟器官質(zhì)量(mg)/處死當(dāng)日體質(zhì)量(g)×100%;腫瘤抑瘤率(%)=(1-T/C)×100%。式中:C為對照組平均瘤質(zhì)量(g);T為給藥組平均瘤質(zhì)量(g)。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)對lewis肺癌細(xì)胞的影響

將lewis小鼠肺癌傳代細(xì)胞用胰酶-EDTA (2∶1)消化液消化,將消化后的細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度,吹打成單細(xì)胞懸液接種于96孔板,100μL/孔,置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃過夜培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,補(bǔ)充含不同濃度天南星水煎液的培養(yǎng)基100μL/孔,每孔5個(gè)復(fù)孔。天南星的終濃度設(shè)為0、1.25、2.5、5、10 g/L,并設(shè)置調(diào)零孔和對照孔,于體積分?jǐn)?shù)為體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)48 h后,棄去藥物,加入5 g/L的MTT 100μL/孔,放置4 h后甩出MTT,加入DMSO 100μL/孔,混勻后于酶標(biāo)儀570 nm處測吸光度A,計(jì)算抑制率。抑制率(%)=1-加藥組OD值/不加藥組OD值× 100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對荷瘤小鼠體質(zhì)量、腫瘤及免疫器官的影響

與對照組小鼠相比較,天南星給藥組小鼠體質(zhì)量下降并不明顯,給藥期間小鼠狀態(tài)良好,見圖1。瘤體積和瘤質(zhì)量與對照組比較,P＞0.05,未見明顯差異,但腫瘤生長速度比對照組緩慢,見表1、圖2。抑瘤率為34.7%,胸腺指數(shù)明顯下降,與對照組比較,有顯著差異;肝臟指數(shù)略微下降,脾臟指數(shù)略微升高,與對照組比較無明顯差異,見表1。

表1 天南星對H22荷瘤小鼠體征的影響(±s,n=10)

表1 天南星對H22荷瘤小鼠體征的影響(±s,n=10)

注:與模型組比較,*P＜0.01。

組別 劑量/(m L/10 g) 瘤質(zhì)量/(g) 胸腺指數(shù)/(mg/g) 脾臟指數(shù)/(mg/g) 肝臟指數(shù)/(mg/g)模型組 — 1.28±0.31 0.94±0.18 5.26±1.29 56.91±5.779天南星組 0.2 0.84±0.28*0.39±0.24*6.11±0.72 55.11±5.38

圖1 荷瘤肝癌小鼠生長曲線

圖2 H22荷瘤小鼠腫瘤生長曲線

3.2 天南星對小鼠lewis肺癌的抑制作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,天南星在實(shí)驗(yàn)濃度下對lewis肺癌細(xì)胞生長無明顯影響,見表2。

表2 天南星對lewis肺癌細(xì)胞的抑制率

4 討論

天南星為天南星科天南星屬植物天南星、異葉天南星的塊莖。性溫,味苦、辛,有毒。功能為燥濕化痰、祛風(fēng)止痙、解毒散結(jié),主治痰濕咳嗽、中風(fēng)痰厥、癲癇、破傷風(fēng)等癥[5-6]。

隨著人們對天南星研究的不斷深入,已從天南星中分離出多種化學(xué)成分,如三萜皂苷、安息香酸(benzoicacid)、淀粉等,另外還有0.419 1%的氨基酸,0.596%的β-谷甾醇和鈣、磷、鋁、鋅等21種無機(jī)元素[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn),天南星毒性成分為苛辣性毒素,其中D甘露醇可能是抗癌的有效成分[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,天南星經(jīng)煎煮除毒后,用CMC-Na配置成100 g/L的混懸液,對腫瘤生長有明顯的抑制作用。另外,已有研究證明,含天南星的三生針注射液,對小鼠肝癌細(xì)胞的生長有明顯抑制作用,可抑制生物大分子合成,對DNA、RNA的合成抑制強(qiáng)于對蛋白質(zhì)合成的抑制,但對外圍血淋巴細(xì)胞ANAE陽性率、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均無明顯影響,因此,有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[]。

本次試驗(yàn)所得抑瘤率為34.7%,可以確定天南星的抗腫瘤作用。眾所周知,惡性腫瘤的發(fā)生與機(jī)體的免疫力低下或缺失密切相關(guān)。機(jī)體的免疫功能狀態(tài)隨著腫瘤的不斷生長而進(jìn)行性下降,多種特異性和非特異性免疫功能均受到顯著抑制。免疫系統(tǒng)功能正常與否與腫瘤治療成敗有著重要的關(guān)系,本次實(shí)驗(yàn)通過測量脾臟、胸腺等免疫器官的臟器指數(shù),發(fā)現(xiàn)天南星對小鼠脾臟和肝臟無顯著性影響。惡性腫瘤的特點(diǎn)是易復(fù)發(fā)擴(kuò)散,用天南星粉可以有效防治其復(fù)發(fā)和擴(kuò)散,起到以毒攻毒,攻補(bǔ)兼施的作用。但天南星中的苛辣性毒素又是毒性成分,使用劑量不當(dāng),誤食或超量內(nèi)服可對皮膚和黏膜產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激作用,可引起口腔咽喉麻辣、癢感或大量流涎、味覺喪失、言語不清、聲音嘶啞、張口困難、口腔黏膜輕度水腫、糜爛、頭痛、心慌、面色蒼白、四肢麻木,繼而出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及全身毒性反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)可產(chǎn)生驚厥、呼吸困難,最后使呼吸中樞完全麻痹而死亡,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)中樞也會(huì)受到影響[10]。加入其他的活性成分(如生姜),可降低其毒性作用,增加療效。

體外實(shí)驗(yàn)中,在實(shí)驗(yàn)濃度下天南星對lewis肺癌細(xì)胞的生長無明顯影響,提示天南星的抗腫瘤作用與細(xì)胞毒作用無關(guān),其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]楊嘉,劉文煒,霍昕,等.天南星揮發(fā)性成分研究[J].生物技術(shù),2007,17(5):53.

[2]汪蕾,張繼振.天南星屬植物研究進(jìn)展[J].延邊大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,11(1):6 272.

[3]江年瓊.半夏·天南星[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社, 2001:119-121.

[4]曾少賢,肖逸,張廷華,等.復(fù)方三生注射液抗癌作用機(jī)制的初步研究[J].中藥通報(bào),1987,12(11):45-46.

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[責(zé)任編輯 時(shí) 紅]

Preliminary study of rhizome arisaematis on anti-tumor

QI Xiaoxiao，LI Hong，DU Gangjun*
（Institute of Pharmacy，Pharmaceutical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

Objective To investigate the antitumor effect of rhizome arisaematis.Methods In vivo，hepatoma H22cancer of mouse subcutaneously transplanted model was used and the mice were administrated rhizome arisaematis twice daily.The anti-tumor roles of rhizome arisaematis were evaluated by detecting tumor volume，weight and immune organ index.In vitro，the effect of rhizome arisaematis on lewis cells was observed by MTT.Results In vivo，compared with control group，the tumor in rhizome arisaematis group was smaller，the tumor inhibitory rate was 34.7%，both of liver index and thymus index decreased，spleen index increased.In vitro，rhizome arisaematis at used doses has no effect on lewis lung cancer cells.Conclusion Rhizome arisaematis has beneficial effects on tumor treatment，and its antitumor isn't cytotoxicity.

rhizome arisaematis；MTT；H22；lewis

R285.5

A

1672-7606(2014)02-0085-03

2013-09-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173094);河南省高校青年骨干教師項(xiàng)目(2010GGJS-025);河南省科技廳重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(112101310308);河南大學(xué)省部共建項(xiàng)目(SBGJ090704)。

戚笑笑(1990-),女,河南駐馬店人,碩士研究生,從事中藥抗腫瘤藥理學(xué)研究工作。

*通訊作者:杜鋼軍(1971-),男,博士,教授,從事中藥抗腫瘤藥理學(xué)的研究工作。