王紅鋼,張相紅,趙 帥

(1.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,河南開封475004;2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南開封475004;3.開封市中醫(yī)院,河南開封475000)

重復(fù)序列競爭反式調(diào)節(jié)因子模型的構(gòu)建和初步研究

王紅鋼1,張相紅2,趙 帥3

(1.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,河南開封475004;2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南開封475004;3.開封市中醫(yī)院,河南開封475000)

目的 構(gòu)建不同拷貝數(shù)的重復(fù)串聯(lián)序列表達(dá)質(zhì)粒,研究串聯(lián)重復(fù)序列對表達(dá)質(zhì)粒中GFP報告基因表達(dá)的影響作用。方法 將不同拷貝數(shù)的2F2R、AC和AT串聯(lián)重復(fù)序列插入p EGFP-Alu14或p EGFP-C1中,構(gòu)建表達(dá)載體,瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,提取RNA做Northern印記檢測。結(jié)果 在4個拷貝數(shù)范圍以內(nèi),2F2R隨拷貝數(shù)增加活化基因作用增強,再增加拷貝數(shù)其活化基因作用反而下降;裝有重復(fù)序列的質(zhì)粒隨轉(zhuǎn)染劑量上升表達(dá)先上升后下降。結(jié)論 重復(fù)序列可能通過競爭反式調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

重復(fù)串聯(lián)序列;GFP;Northern blot;轉(zhuǎn)染

哺乳動物基因組中有將近98%的序列屬于不編碼蛋白質(zhì)的非編碼序列,而大腸桿菌基因組中非編碼序列約占11%。大部分非編碼序列的功能還未搞清楚,曾被認(rèn)為是“垃圾序列”[1]。但近些年的研究[2-3]表明,非編碼序列不僅在調(diào)控基因表達(dá),甚至在生物進(jìn)化中都有著非常重要的作用。因此研究非編碼序列對了解基因表達(dá)調(diào)節(jié)的機(jī)制、進(jìn)而探尋非編碼序列新的生物學(xué)功能以及認(rèn)識人和哺乳動物的生物學(xué)行為,包括分化和衰老,都有重要價值?；騻?cè)翼的非編碼序列包含重要的調(diào)控元件,包括轉(zhuǎn)錄終止信號、增強子、5′UTR和3′UTR等,對基因表達(dá)調(diào)節(jié)產(chǎn)生重要影響[4-5]。人基因組的非編碼序列中約60%屬于不同類型的重復(fù)序列,其中很多重復(fù)序列又屬于串聯(lián)重復(fù)序列,它們可影響染色體的結(jié)構(gòu)并在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)[6-8]。原核和真核生物基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)含有很多串聯(lián)重復(fù)序列[9],在調(diào)控基因的活性中發(fā)揮著重要作用,如酵母基因的上游存在多種串聯(lián)重復(fù)序列:TATA盒、GC盒和CCAAT盒[10];噬菌體N4啟動子區(qū)含有多個5～7 bp長的反向串聯(lián)重復(fù)序列,該序列間隔3個堿基,是噬菌體轉(zhuǎn)錄所必需的[11-12]。重復(fù)序列在哺乳動物基因組中存在,有重要的生物學(xué)意義[13-16]。

我們擬從重復(fù)序列參與基因表達(dá)調(diào)節(jié)的角度初步探討反式調(diào)節(jié)因子參與基因表達(dá)的機(jī)理,通過重復(fù)序列質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞構(gòu)建模型來研究重復(fù)序列競爭反式調(diào)節(jié)因子,使復(fù)雜系統(tǒng)的解釋變得相對簡單,有可能發(fā)現(xiàn)新的基因調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

p Alu14質(zhì)粒為本研究室前期工作構(gòu)建,系將14 Alu元件同向、正向串連插p EGFP-C質(zhì)粒的GFP基因下游;pEGFP-C1質(zhì)粒為空載體,不含有插入序列[3];p EGFP-C1質(zhì)粒、DH5α菌株和HeLa細(xì)胞均為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 合成引物和作為模板的DNA片段 委托DNA合成公司(賽百盛,北京)合成帶適當(dāng)酶切位點的引物,上游引物帶EcoRⅠ/XbaⅠ(或HindⅢ/ XbaⅠ)酶切位點,下游引物帶KpnⅠ/NheⅠ酶切位點。通過PCR擴(kuò)增將酶切位點引入到擴(kuò)增產(chǎn)物中,便于下一步將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連入質(zhì)粒。

1.2.2 表達(dá)載體構(gòu)建 用帶有酶切位點的引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段,目的片段為p EGFP-C1質(zhì)粒中的SV40Poly A片段第二個60 bp片段2F2R,擴(kuò)增片段序列為2F2R:5-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTAT-3′。構(gòu)建表達(dá)載體涉及兩個過程:①將PCR擴(kuò)增片段插入p EGFP-C1質(zhì)粒,構(gòu)建單體和2串連體質(zhì)粒;②將構(gòu)建的p EGFP-C1質(zhì)粒中的插入片段(單體或2串連體)用限制酶切下,經(jīng)電泳、膠分離后插入p Alu14質(zhì)粒的GFP基因和Alu串連序列之間,即插入GFP下游,Alu串連序列的上游。具體方法是用EcoRⅠ/KpnⅠ(或HindⅢ/XbaⅠ)雙酶切p EGFP-C1質(zhì)粒,同時用同樣的酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,T4 DNA連接酶連接后得到插入一個片段的表達(dá)載體。NheⅠ酶切產(chǎn)生一個5′CTAG突出端,可以與Xba酶切產(chǎn)生的質(zhì)粒大片段有效連接。但是連接以后的位點不能被其中的任何一個酶切斷。我們利用此特性制備同向二串連體,文中涉及的二串連體(如F2R*2)均用這種方法制備。再將p EGFP-C1質(zhì)粒中的插入片段(單體或2串連體)用HindⅢ/Nhe切下,連入經(jīng)HindⅢ/XbaⅠ酶切的p Alu14質(zhì)粒中。經(jīng)PCR、酶切和測序(諾賽基因,北京)鑒定正確以后用于實驗[4-5]。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用質(zhì)粒(包括重組表達(dá)載體和p EGFP-C1)0.4μg和LipofectamineTM2000(Invitrogen·Carlsbad,USA)2μL瞬時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于24孔板的HeLa細(xì)胞,置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)36 h,用Trizol試劑提取總RNA用于Northern印記檢測。

1.2.4 Northern印記檢測 用9N隨機(jī)引物和大腸桿菌DNA聚合酶大片段,將α-32P-dCTP摻入DNA(590 bp)中制備GFP探針。590 bp DNA片段擴(kuò)增自GFP基因并經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳純化,上、下游引物分別為;5′-GGGCGAGG GCGATG-3′和5′-CTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′。提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA,甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜。32P標(biāo)記的GFP探針雜交、沖洗后通過放射自顯影記錄實驗結(jié)果。后將這種雜交過的尼龍膜用剝離液處理,去除32P-GFP探針,用檢測neo RNA的探針再次雜交,放射自顯影作為轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參對照。Neo探針用隨機(jī)引物法標(biāo)記,標(biāo)記模板為Neo基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(671 bp),擴(kuò)增671 bp Neo DNA的上、下游引物分別為5′-CACA ACAGACAATCGGCTGCT-3′和5′-AGCGGCGATACCGTAAAGCAC-3′。

2 結(jié)果

2.1 合適拷貝數(shù)的2F2R活化基因作用強

圖1中,插入2、4個2F2R活化基因作用最強(2和3泳道比較7泳道),插入8、16、64個拷貝的2F2R,促進(jìn)基因表達(dá)的作用依次下降(4、5、6泳道)。8泳道插入片段的長度與6泳道類似,但是8泳道的質(zhì)粒(p2F2R*4-Alu28)GFP基因表達(dá)多,說明6泳道插入64個2F2R導(dǎo)致基因表達(dá)抑制不是因為片段長度造成的。

2.2 裝有重復(fù)序列的質(zhì)粒隨轉(zhuǎn)染劑量上升表達(dá)先上升后下降

圖2中,1、2、3泳道為p EGFP-AC640(AC重復(fù)640 bp),轉(zhuǎn)染劑量分別為0.5、1.0、2.0μg(12孔板實驗)。隨轉(zhuǎn)染劑量增加GFP表達(dá)減少;4、5、6泳道為p EGFP-AT640(AT重復(fù)640 bp),轉(zhuǎn)染劑量同1、2、3泳道。隨轉(zhuǎn)染劑量增加,GFP表達(dá)先上升后下降。7、8、9泳道為pEGFP-C1空質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染劑量同1、2、3泳道。轉(zhuǎn)染劑量高則GFP表達(dá)多。說明在一定范圍內(nèi),隨著轉(zhuǎn)染劑量的增加,報告基因的表達(dá)量先上升然后下降。

圖1 2F2R拷貝數(shù)對GFP報告基因表達(dá)的作用

圖2 轉(zhuǎn)染劑量與GFP基因表達(dá)的關(guān)系

3 討論

已知質(zhì)粒中的SV40Poly A第二個片段2F2R在HeLa細(xì)胞中上調(diào)熒光素酶(Luciferase)報告基因表達(dá)[17]。我們的前期工作發(fā)現(xiàn),Alu重復(fù)序列插入GFP基因下游,可以抑制GFP報告基因表達(dá),在GFP和Alu序列之間插入2F2R(來自SV40Poly A, 60 bp)能夠解除Alu序列對GFP報告基因的抑制作用。2F2R串連越多活化基因作用是否越強,我們進(jìn)行了實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn),4個2F2R串連體活化基因作用最強,超過4個以后串連的越長活化基因作用越弱。我們又在表達(dá)載體是p EGFP-C1質(zhì)粒中GFP基因下游插入的重復(fù)序列是5'-AC反復(fù)重復(fù)共640 bp構(gòu)建重復(fù)序列表達(dá)載體,同樣用5'-AT(640 bp)構(gòu)建類似的表達(dá)載體,將這兩種重復(fù)序列表達(dá)載體和p EGFP-C1質(zhì)粒按不同劑量轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用重復(fù)序列構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞時,在一定范圍內(nèi)隨著轉(zhuǎn)染劑量的增加報告基因的表達(dá)量反而下降,而對照質(zhì)粒p EGFP-C1質(zhì)粒不出現(xiàn)該種現(xiàn)象。本文實驗中使用的質(zhì)粒是p EGFP-C1,插入序列位于GFP基因下游,不涉及啟動子和編碼序列,所以實驗結(jié)果不會對啟動子的影響造成。根據(jù)實驗結(jié)果我們認(rèn)為,基因活化需要反式調(diào)節(jié)因子,同樣的基因在不同的細(xì)胞中表達(dá)不同是由于它們有不同的反式調(diào)節(jié)因子,細(xì)胞中反式調(diào)節(jié)因子的量是有限的,過多的基因(包括影響基因表達(dá)的側(cè)翼序列)會競爭有限的反式調(diào)節(jié)因子使基因表達(dá)減弱。該看法與現(xiàn)有的關(guān)于等位基因排斥的學(xué)說如組蛋白修飾、DNA甲基化、非編碼RNA涂布等并不矛盾。

對于多拷貝順式排列的活化基因序列抑制基因表達(dá)現(xiàn)象,我們的解釋是反式調(diào)節(jié)因子只有作用在毗鄰GFP基因的2F2R上才可以發(fā)揮活化基因的作用,過多的串連2F2R會消耗反式調(diào)節(jié)因子,使有效部位結(jié)合的反式調(diào)節(jié)因子減少,從而消弱活化基因作用。同樣的原理也可以解釋反式排列時的基因表達(dá)抑制,活化基因需要一定量的反式調(diào)節(jié)因子,反式調(diào)節(jié)因子的結(jié)合量只有達(dá)到閾值才可以活化基因,過多的基因會導(dǎo)致每個基因結(jié)合的反式調(diào)節(jié)因子的量均不足,反而使基因表達(dá)減弱。

如果上述假設(shè)成立,重復(fù)序列競爭反式調(diào)節(jié)因子而影響基因活性將成為基因表達(dá)調(diào)節(jié)的一項新機(jī)制,同時也為重復(fù)序列增加一項新的生物學(xué)功能。本文構(gòu)建了一個串聯(lián)重復(fù)序列競爭反式調(diào)節(jié)因子的模型,僅作為研究重復(fù)序列競爭反式調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)機(jī)理的開始,后續(xù)還有很多工作有待進(jìn)行。

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[責(zé)任編輯 姬 荷]

The construction and research of the model of repeated sequences competing trans-regulation factors

WANG Honggang1，ZHANG Xianghong2，ZHAO Shuai3
（1.Department of Biochemistry and Molecular Biology，Medical College，Henan University，Kaifeng，Henan 475004；2.The first affiliated hospital of Henan University，Kaifeng，Henan 475004；3.The hospital of traditional Chinese medicine of Kaifeng city，Kaifeng，Henan 475000）

Objective We constructed expression plasmids of repeated tandem sequences of different copy number and researched the influence of GFP reporter gene expression by repeated tandem sequences.Methods We constructed Expression vectors by inserting repeated tandem sequences of 2F2R、AC and AT of different copy number into p EGFP-Alu14 or p EGFP-C1，transfected with HeLa cells and extracted RNA to commit Northern blot Results With the scope of 4 copies，the effect of activating gene of 2F2R increased following the increase of copy number，but following copy number was increased again，the effect of activating gene of 2F2R decreased instead. the expression of plasmids inserted with repeated sequences increased firstly and decreased later.Conclusion The repeated sequences may regulate gene expression by competing trans-regulation factors.

repeated tandem sequences；GFP；Northern blot；transfection

Q786

A

1672-7606(2014)04-0263-04

2014-09-05

河北省自然科學(xué)基金(c2011206043)。

王紅鋼(1975-),男,河南開封人,博士,副教授,從事基因表達(dá)調(diào)節(jié)的教學(xué)和科研工作。