周 麗,王立東,范宗民,尹艷春,李江曼,宋 昕,孔國強(qiáng),常扶保,郭海云,常智慧,陳志國,郭志剛,任景麗,5

(1.鄭州市第九人民醫(yī)院姑息治療暨安寧療護(hù)病區(qū),河南鄭州450053;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點開放實驗室,鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南鄭州450052;3.林州市中心醫(yī)院,河南林州456592;4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院癌癥研究中心,河南新鄉(xiāng)453003;5.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科,河南鄭州450014)

賁門癌組織乙酰肝素酶和YY1蛋白表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

周 麗1,王立東2*,范宗民2,尹艷春2,李江曼2,宋 昕2,孔國強(qiáng)2,常扶保3,郭海云3,常智慧3,陳志國4,郭志剛4,任景麗2,5

(1.鄭州市第九人民醫(yī)院姑息治療暨安寧療護(hù)病區(qū),河南鄭州450053;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點開放實驗室,鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南鄭州450052;3.林州市中心醫(yī)院,河南林州456592;4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院癌癥研究中心,河南新鄉(xiāng)453003;5.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科,河南鄭州450014)

目的 研究乙酰肝素酶(HPA)和YY1蛋白(YY1)在賁門癌組織中表達(dá)特征及其與患者預(yù)后的關(guān)系。方法 采用組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)(ABC)法檢測HPA和YY1蛋白在45例賁門癌組織中的表達(dá),所有賁門癌組織均來自林州市中心醫(yī)院,并對患者隨訪5 a以上。結(jié)果 45例賁門癌組織HPA陽性表達(dá)率為56%(25/45), YY1陽性表達(dá)率為22%(10/45);HPA表達(dá)陽性和陰性組食管癌患者的平均生存時間及95%的可信區(qū)間分別為44(35,52)mon和60(56,64)mon,HPA表達(dá)陽性患者生存期顯著小于陰性表達(dá)者(P＜0.05);YY1蛋白表達(dá)陽性和陰性組患者的平均生存時間及95%的可信區(qū)間為54(43,66)mon和50(44,57)mon,YY1蛋白表達(dá)陽性患者生存期大于陰性表達(dá)者,但無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);多因素Cox模型逐步回歸分析結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對患者的影響最大。結(jié)論 HPA和YY1陽性表達(dá)對患者生存期有一定的影響,但不是賁門癌獨立的預(yù)后指標(biāo),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是賁門癌獨立的預(yù)后指標(biāo)。

賁門癌;乙酰肝素酶;YY1蛋白;預(yù)后

賁門癌(gastric cardia adenocarcinoma,GCA)是我國特別是北方地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一,高發(fā)區(qū)賁門癌發(fā)病率可高達(dá)190/萬,其流行病學(xué)特征是與食管癌高發(fā)區(qū)地域的分布有一致性及其與胃遠(yuǎn)側(cè)部位腫瘤的不一致性。林州市居民食管癌占60%,賁門癌占40%[1]。近年來,賁門癌的發(fā)病率呈上升趨勢。賁門癌患者一般梗阻癥狀出現(xiàn)較晚,就診時多已屬中晚期,缺乏敏感、特異的用于早期診斷的指標(biāo)和手段以及高效特異的防治措施和方法,是導(dǎo)致賁門癌死亡率高和預(yù)后差的主要原因。但由于賁門癌解剖位置的特殊性,對賁門癌的單獨研究很少。王立東等[2]研究表明,賁門癌變可能是一個多階段進(jìn)行性發(fā)展的過程,但是,與人類的其他腫瘤相比,人們對賁門癌變的分子學(xué)基礎(chǔ)了解甚少。王立東等[3]研究發(fā)現(xiàn)河南食管癌高發(fā)區(qū)居民食管癌組織出現(xiàn)顯著的乙酰肝素酶(heparanase,HPA)m RNA高表達(dá),并與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān),HPA可能是判斷食管癌預(yù)后的重要分子指標(biāo)。利用蛋白質(zhì)組技術(shù)對賁門癌患者血清蛋白變化特征分析發(fā)現(xiàn)YY1蛋白可能是賁門癌變相關(guān)重要候選蛋白之一[4]。我們的研究旨在通過對賁門癌患者組織中HPA和YY1蛋白表達(dá)情況,加深對賁門癌癌變機(jī)制的了解,并且通過比較這些賁門癌患者的生存期,進(jìn)一步了解HPA和YY1蛋白對賁門癌患者預(yù)后的影響。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

45例賁門癌手術(shù)切除標(biāo)本來自賁門癌高發(fā)區(qū)河南省林州市中心醫(yī)院,其中男性39例,平均年齡(56.82±7.5)歲,中位年齡57歲;女性6例,平均年齡(54.33±8.55)歲,中位年齡55歲?；颊咝g(shù)前均未接受任何放療或化療,標(biāo)本經(jīng)2位病理學(xué)專家證實為賁門腺癌。

1.2 隨訪結(jié)果

對賁門癌切除術(shù)后恢復(fù)良好出院病例進(jìn)行跟蹤隨訪,患者隨訪的時間均在5 a以上,隨訪率為100%。生存期大于5 a的患者占66.7%(30/45),生存期小于5 a的患者占33.3%(15/45)。術(shù)后5 a內(nèi)死亡的15例患者死因均為腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,無其他重大疾病、意外死亡或明顯死因。

1.3 組織處理

所有組織均經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋、連續(xù)切片,切片厚5μm,收集3張連續(xù)切片,1張進(jìn)行HE染色,作組織學(xué)診斷,其余切片作免疫組織化學(xué)染色。HPA表達(dá)的免疫組化染色按卵白素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物(ABC)法。主要試劑為乙酰肝素酶抗體(博士德試劑公司),工作濃度為1∶100;YY1蛋白抗體(sc-7341,Santa Cruz Biotechnology),工作濃度為1∶250;20 g/L小牛凍干血清蛋白(BSA)(Sigma Chemical Inc.USA);ABC試劑盒和DAB底物試劑盒(Vector Laboratories Inc.USA)。對照采用生產(chǎn)第二抗體的正常動物血清封閉非特異性免疫球蛋白反應(yīng)與省略第一抗體作為陰性對照,采用已知的陽性切片作陽性對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行Kaplan-Meier乘積限法作生存分析,擬合Cox回歸模型辨認(rèn)影響賁門癌患者預(yù)后的因素。顯著性水準(zhǔn)a定為0.05。

2 實驗結(jié)果

2.1 HPA免疫組化結(jié)果

2.1.1 HPA陽性表達(dá)率 HPA陽性表達(dá)率為55.6%(25/45)(圖1)。HPA表達(dá)陽性和陰性組賁門癌患者的平均生存時間及95%的可信區(qū)間分別為44 (35,52)mon和60(56,64)mon,采用Kaplan-Meier作生存分析及Log-rank檢驗結(jié)果:X2=6.47,P= 0.011(P＜0.05),顯示HPA表達(dá)陽性患者生存期明顯小于陰性表達(dá)者(圖2)。

圖1 HPA免疫組化在賁門癌中陽性表達(dá)(×200)

圖2 HPA陽性表達(dá)與陰性表達(dá)生存概率曲線圖

圖3 YY1免疫組化在賁門癌中陽性表達(dá)(×200)

圖4 YY1陽性表達(dá)與陰性表達(dá)生存概率曲線圖

2.1.2 賁門癌組織有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與HPA陽性表達(dá)率的關(guān)系 根據(jù)賁門癌組織有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移將所檢標(biāo)本分為兩組,即有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。HPA在兩組中的陽性表達(dá)率分別為71%和42%,經(jīng)Spearman's秩相關(guān)分析:r=0.299,P= 0.046及卡方檢驗:X2=4.018,P=0.045,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表明HPA陽性率表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組有升高趨勢(表1)。

表1 賁門癌組織HPA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

2.2 YY1免疫組化結(jié)果

2.2.1 YY1蛋白陽性表達(dá)率 YY1蛋白陽性表達(dá)率為22.2%(10/45)(圖3)。陽性和陰性組賁門癌患者的平均生存時間及95%的可信區(qū)間為54(43, 66)mon和50(44,57)mon,采用Kaplan-Meier作生存分析及Log-rank檢驗結(jié)果:X2=0.48,P= 0.488(P＞0.05),顯示YY1蛋白陽性表達(dá)患者生存期大于陰性表達(dá)患者,但兩者之間無顯著性差異(圖4)。

2.2.2 YY1蛋白陽性表達(dá)與賁門癌組織浸潤程度的關(guān)系 根據(jù)賁門癌組織浸潤程度將所檢標(biāo)本分為3組,即浸至黏膜及黏膜下層組、浸至肌層組和浸至漿膜層組。YY1蛋白在3組中陽性表達(dá)率分別為100%、67%和17%,經(jīng)Spearman's秩相關(guān)分析:r= 0.397,P=0.007及卡方檢驗Fisher's精確概率法: P=0.030。表明隨賁門癌組織浸潤程度的增加YY1蛋白陽性表達(dá)有下降的趨勢,且有顯著性差異(P＜0.05)(表2)。

表2 賁門癌組織YY1蛋白表達(dá)與癌細(xì)胞浸潤程度的相關(guān)性

2.3 多因素Cox模型逐步回歸分析結(jié)果

將性別、年齡、癌細(xì)胞浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度、HPA和YY1蛋白8種因素作為自變量,賁門癌患者生存期作為應(yīng)變量,量化后進(jìn)行Cox多因素分析(表3)。多因素Cox回歸模型表明,有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HPA陽性表達(dá)對患者生存期的影響較大,有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是賁門癌患者獨立預(yù)后指標(biāo)(P＜0.05),但HPA陽性表達(dá)不是賁門癌患者獨立預(yù)后指標(biāo)(P＞0.05)(表4)。

表3 Cox回歸各因素量化表

表4 Cox逐步回歸分析結(jié)果

3 討論

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個多階段多步驟的復(fù)雜過程,但須經(jīng)歷腫瘤細(xì)胞穿過細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜組成的屏障和新血管生成兩個過程。細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜是阻止腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移的第一道屏障,主要由結(jié)構(gòu)蛋白(包括膠原蛋白、層黏蛋白、玻璃體結(jié)合素與纖維結(jié)合素等)和糖氨聚糖二種成分構(gòu)成,而硫酸乙酰肝素蛋白聚糖是構(gòu)成糖氨聚糖主要成分之一,主要由一個蛋白核心和數(shù)個與之共價連接的線性硫酸乙酰肝素(heparansulfate,Hs)側(cè)鏈組成。目前認(rèn)為HPA是哺乳動物體內(nèi)唯一能夠降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的一種β-D-葡萄糖醛酸內(nèi)切酶[5]。HPA主要分布在胎盤、脾臟、淋巴結(jié)、胸腺等免疫組織器官和細(xì)胞內(nèi),在成熟的組織如心臟、腦、腎等無明顯表達(dá)。王立東等[3]證實正常人食管上皮組織中幾乎檢測不到HPA m RNA的表達(dá),提示正常食管上皮細(xì)胞HPA的基因轉(zhuǎn)錄水平極低。我們的研究發(fā)現(xiàn)HPA在賁門癌組織中表達(dá)明顯增加,并且HPA表達(dá)陽性患者生存期顯著小于陰性表達(dá)者,有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。這一研究表明,HPA是一個與賁門癌腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的指標(biāo),HPA可能是賁門癌預(yù)后不良的重要分子事件之一。有研究[6]表明乙酰肝素酶在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤新生血管形成過程中有重要作用,它的表達(dá)與胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、乳腺癌等的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)。更為重要的是它可能成為癌癥治療的一個新的靶位點,許多肝素酶抑制劑在抗腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和新血管生成的研究結(jié)果證實了這一點[7-8]。目前乙酞肝素酶抑制劑硫酸化磷酸甘露戊糖正在進(jìn)行臨床二期試驗評估[8],隨研究的深入,有望成為癌癥治療的新途徑之一。

轉(zhuǎn)錄因子YY1屬于具轉(zhuǎn)錄因子有鋅指結(jié)構(gòu)的GLIKruppel蛋白家族,YY1廣泛分布在正常上皮細(xì)胞中。我們的研究發(fā)現(xiàn)YY1在賁門癌組織中表達(dá)明顯下降, YY1蛋白表達(dá)陽性患者生存期長于陰性表達(dá)者,但無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。這一發(fā)現(xiàn)證實了馮笑山等所做的血清蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果,即YY1在腫瘤組織中表達(dá)比正常組織中表達(dá)下降。YY1蛋白最初是作為腺伴隨病毒的P5啟動子和免疫球蛋白(Ig)k3′增強(qiáng)子的阻抑因子分離到的,后來又相繼證實c-fos、c-myc、surf1、surf2、rp L30、rp L32、grp78、IFN2γ等基因的轉(zhuǎn)錄也受YY1的抑制調(diào)控[9-11]。Shi等[10-11]發(fā)現(xiàn),腺病毒E1A蛋白能將YY1從轉(zhuǎn)錄阻抑因子轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)錄激活因子; Thomas等[12]發(fā)現(xiàn),YY1也可作為c-myc、rp L30基因的轉(zhuǎn)錄激活因子;所以,YY1具有阻抑和激活轉(zhuǎn)錄的雙重功能。YY1也是腫瘤抑制基因p53的另一調(diào)控因子, YY1與p53相互影響,通過抑制p53與其共活化物p300的相互作用,控制p53的轉(zhuǎn)錄活性和乙?；?并且破壞p53的穩(wěn)定性。再者,YY1也能與MDM2基因的相互作用,MDM2表達(dá)的增強(qiáng)促進(jìn)了p53-MDM2復(fù)合物的裝配[13]。Mdm2能標(biāo)記出需要降解的蛋白,這樣就導(dǎo)致細(xì)胞中p53的量減少。YY1也能直接阻斷p53與輔助因子之間的作用,使p53失去促使DNA損傷細(xì)胞自殺的功能。

[1]王立東,高文俊,楊萬才,等.林州市人民醫(yī)院9a間食管、賁門癌3933例分析[J].河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1997,32 (1):9-11.

[2]王立東.食管和賁門癌癌變多階段演進(jìn)機(jī)制[J].中華腫瘤防治雜志,2006,13(5):321-325.

[3]李燕杰,何欣,王立東,等.河南食管癌高發(fā)區(qū)居民食管癌和癌旁組織乙酰肝素酶mRNA表達(dá)及其臨床意義[J].河南醫(yī)學(xué)研究,2003,12(3):201-204.

[4]馮笑山,王立東,郭濤,等.食管與賁門雙源癌蛋白質(zhì)指紋模型的建立及腫瘤標(biāo)志的篩選[J].中華腫瘤防治雜志,2007,18(8):564-568.

[5]Vlodavsky,Friedmann Y.Molecular properties and involvement of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis[J].Clin Invest,2001,108(3):341-347.

[6]Eccles S A.Heparanase:breaking down barriers in tumors[J].Nat Med,1999,5(7):735-736.

[7]Miao H Q,Elkin M,Aingorn E,et al.Inhibition of heparanase activity and tumor metastasis by laminarin sulfate and synthetic phosphorothioate oligodeoxynucleotides[J].Int J Cancer,1999,83(3):424-431.

[8]Parish C R,Freeman C,Brown K J,et al.Identification of sulfated oligosaccharide-based inhibitors of tumor growth and metastasis using novel in vitro assays for angiogenesis and heparanase activity[J].Cancer Res,1999, 59(14):3 433-3 441.

[9]Shrivastava A,Saleque S,Kalpana G V,et al.Inhibition of transcriptional regulate YY1 by association with c-Myc [J].Science,1993,262(5 141):1 889-1 892.

[10]Shi Y,Lee J S,Galvin K M.Everything you have ever wanted to know about YY1[J].Biochim Biophys Acta, 1997,1 332(2):49-66.

[11]Shi Y,Seto E,Chang L S.Transcriptional repression by YY1,a human GLI-Kruppel-related protein,and relief of repression by adenovirus E1A protein[J].Cell,1991,67 (2):377-388.

[12]Thomas M J,Lee J S,Galvin K M.Unlocking the mechanisms of transcription factor YY1:are chromatin modifying enzymes the key?[J].Gene,1999,236(2): 197-208.

[13]Gronroos E,Terentiev A A,Punga T,et al.YY1 inhibits the activation of the p53 tumor suppressor in response to genotoxic stress[J].Natl Acad Sci USA, 2004,101(33):12 165-12 170.

[責(zé)任編輯 姬 荷]

The expression and prognosis of Heparanase and Protein YY1 in gastric cardia adenocarcinoma（GCA）

ZHOU Li1，WANG Lidong2*，F(xiàn)AN Zongmin2，YIN Yanchun2，LI Jiangman2，SONG Xin2，KONG Guoqiang2，CHANG Fubao3，GUO Haiyun3，CHANG Zhihui3，CHEN Zhiguo4，GUO Zhigang4，REN Jingli2，5
（1.The ninth People's Hospital in Zhengzhou City，Palliative care and hospice care ware Zhengzhou 450053，China；2.Henan Key Laboratory for Cancer Research，The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Bisic Medical College of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；3.Central Hospital of Linzhou，Linzhou 456592，China；4.Cancer Research Center，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China；5.Department of Pathology，the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450014，Chin）

Objective To characterize the expression and prognosis of heparanase and protein YY1 in gastric cardia adenocarcinoma（GCA）.Methods Histopathological analysis and immunohistochemical staining（ABC）were applied to detect the expression of heparanase and protein YY1 on 45 cases in GCA.All the tissues of GCA were from Central Hospital of Linzhou and were followed up more than 5 years after surgery.Results The positive expression rate for heparanase was 56%（25/45）and for YY1 was 22%（10/45）in GCA.The mean survival periodsand 95%confidence interval for those with positive and negative expression of heparanase were 44（35，52）and 60（56，64）months，respectively.Patients with positive expression for heparanase survived obviously less than those with negative expression，and the difference was significant（P＜0.05）.The mean survival periods and 95% confidence interval for those with positive and negative expression of protein YY1 were 54（43，66）and 50（44，57）months，respectively.There was no significant difference between positive and negative expression in mean survival periods for YY1（P＞0.05）.Stepwise multivariate analysis showed that lymphatic metastasis was the most important factor affecting the prognosis of GCA（P＜0.05）.Conclusion The expression of heparanase and YY1 is related with mean survival periods in GCA，but may be not independent prognostic indicators for poor prognosis of GCA.lymphatic metastasis is one of the most important independent factors in the prognosis of GCA.

gastric cardia cancer；heparanase；protein YY1；prognosis

R735.1

A

1672-7606(2014)04-0259-04

2014-08-10

國家杰出青年科學(xué)基金(30025016);河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項目(20058)。

周麗(1976-),女,河南信陽人,碩士,主治醫(yī)師,從事腫瘤專業(yè)的臨床及科研工作。

*通訊作者:王立東(1958-),男,河南獲嘉人,博士,教授,博士生導(dǎo)師,從事食管癌和賁門癌癌變機(jī)制和防治的研究工作。