敬永升,李艷芳

(河南大學藥學院,河南開封475004)

RP-HPLC法測定王氏保赤丸中鹽酸小檗堿的含量

敬永升,李艷芳

(河南大學藥學院,河南開封475004)

目的 建立RP-HPLC法測定王氏保赤丸中鹽酸小檗堿的含量。方法 采用反相高效液相色譜法測定,以Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)為色譜柱,以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(28∶72)磷酸調p H3.0為流動相。柱溫:室溫,流速:1.0 m L/min,檢測波長:349 nm。結果 鹽酸小檗堿在0.20～1.20μg范圍內的線性關系良好,其線性方程為A=3673.7 m+5.5251,r=0.9999,平均回收率為100.49%,RSD=1.46%(n=9)。結論RP-HPLC法測定王氏保赤丸中鹽酸小檗堿的含量線性關系良好、精密度較好、準確度較高、穩(wěn)定性良好,可用于王氏保赤丸的質量控制。

王氏保赤丸;鹽酸小檗堿;RP-HPLC;含量測定

王氏保赤丸主要用于兒童乳滯疳積、喘咳痰鳴、吐瀉發(fā)熱、乳食減少、四時感冒、大便秘結以及脾胃虛弱、發(fā)育不良等癥,對成年人的腸胃不清、痰食阻滯也同樣有療效[1-2]。人體實驗表明,王氏保赤丸能推進腸道內容物的速度及加速胃排空,明顯激活消化酶中胃蛋白酶的活性[3]。本品耐受性大,毒性試驗表明,其最大耐受量是臨床用量的1 000倍。該方是由大黃、黃連等8味藥按處方制成的中成藥。文獻報道[4-6]鹽酸小檗堿的含量測定大多為薄層掃描法,高效液相色譜法測定王氏保赤丸中鹽酸小檗堿的含量較少見。為進一步評價該制劑質量,我們采用RPHPLC法對該方主藥中的鹽酸小檗堿進行含量測定。通過對流動相的摸索、調整和一系列的方法學驗證,證實該方法簡便、靈敏、準確,能夠對王氏保赤丸中鹽酸小檗堿進行較好的分離,并對其含量準確測定,可用于該產(chǎn)品中鹽酸小檗堿的質量控制和質量檢測。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV-2600型紫外檢測器(日本島津);Agilent高效液相色譜儀;色譜柱Diamonsil-C18柱(250 mm× 4.6 mm,5μm)、一次性進樣器(大連依利特科學儀器有限公司);HS10260D型超聲波清洗機(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);0.22μm有機微孔濾膜等。

1.2 試劑

鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110713-200911);王氏保赤丸(中國南通精華制藥股份有限公司,生產(chǎn)批號:Z32020645);甲醇(高效液相色譜專用,一級色譜純,天津四友生物醫(yī)學技術有限公司)、乙腈為色譜純,磷酸二氫鉀、磷酸均為分析純,純凈水(樂百氏有限公司),蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 實驗溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品10.00 mg于100 m L容量瓶中,加入甲醇適量溶解并定容,搖勻即得100μg/m L的鹽酸小檗堿對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取王氏保赤丸2管,研磨充分,精密稱重,置10 m L容量瓶中,加甲醇適量,超聲提取1 h使之完全溶解,冷卻至室溫,加甲醇定容,靜置,用0.22μm微孔濾膜濾過,即制得鹽酸小檗堿供試品溶液。

2.2 實驗條件的選擇

色譜柱:Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流動相:乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(28∶72)磷酸調p H3.0,柱溫:室溫,流速:1.0 m L/min,檢測波長:349 nm,進樣量:10μL,在該色譜條件下,進樣檢測得到鹽酸小檗堿對照品溶液的HPLC圖譜(見圖1)及供試品溶液的HPLC圖譜(見圖2)。

圖1 鹽酸小檗堿對照品溶液的HPLC圖譜

圖2 鹽酸小檗堿供試品溶液的HPLC圖譜

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 采用高效液相色譜儀考察。用一次性進樣器取2.1.1項下的鹽酸小檗堿對照品溶液(100μg/m L),以0.22μm有機微孔濾膜過濾后,注入樣品瓶中,依次進樣2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μL(0.20～1.20μg),按2.2項下的色譜條件進行測定,分別記錄色譜圖。各進樣量重復進樣3次,取其三次峰面積平均值,以峰面積A對進樣量m進行線性回歸,得回歸方程為:A=3 673.7m+ 5.525 1,(r=0.999 9),結果表明,鹽酸小檗堿在0.20～1.20μg范圍內線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 用一次性進樣器取2.1.2項下的鹽酸小檗堿對照品溶液(100μg/m L),以0.22μm有機微孔濾膜過濾后,注入樣品瓶中,每次進樣10μL,重復進樣6次,分別記錄其峰面積,計算RSD為0.12%(n=6),結果表明,該方法精密度較好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 用一次性進樣器取2.3.6含量測定項下鹽酸小檗堿供試品溶液,以0.22μm有機微孔濾膜過濾后,注入樣品瓶中,每隔2 h進樣1次,共進樣6次,每次進樣5μL,記錄色譜圖,測定峰面積,計算RSD為0.55%(n=6)。結果表明,供試品溶液在10 h內穩(wěn)定。

2.3.4 重復性試驗 取同一批樣品,按2.3.6含量測定項下方法配制鹽酸小檗堿樣品溶液6份,以0.22μm有機微孔濾膜過濾后,分別注入樣品瓶中,每份取5μL進樣,分別記錄色譜圖,測定鹽酸小檗堿峰面積,計算RSD為1.33%,結果表明,該實驗方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取含量測定項下已知含量的鹽酸小檗堿供試品3份,每份0.050 0 g,計算得鹽酸小檗堿供試品中鹽酸小檗堿的含量為

5.137 mg/g,即0.050 0 g的鹽酸小檗堿供試品相當于鹽酸小檗堿0.257 mg。按對照品的80%、100%、120%的比例加入2.1.1項下制備的對照品溶液,即相當于依次加入鹽酸小檗堿對照品溶液(100μg/m L)2.10 m L、2.60 m L、3.10 m L。加樣后,分別置于10 m L的容量瓶中,加入甲醇適量,置超聲儀內超聲提取1 h使之完全溶解,冷卻至室溫,用甲醇稀釋至刻度,靜置,以0.22μm微孔濾膜濾過,即得待測溶液。按2.3.6項下的樣品含量測定方法進行檢測,每次進樣5μL,記錄色譜圖,計算得平均回收率為100.49%,RSD=1.46%(n=9),結果顯示,該方法準確度較好。

2.3.6 樣品含量測定 按2.1項下所述供試品溶液的制備方法配制6份不同批號鹽酸小檗堿供試品溶液,分別用0.22μm濾膜濾過,取續(xù)濾液,裝入樣品瓶中,按2.2項下色譜條件每份進樣3次,每次進樣5μL,記錄色譜圖,測定峰面積,由回歸方程計算鹽酸小檗堿的含量。結果見表1。

表1 含量測定試驗

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

在200 nm～400 nm波長范圍下掃描鹽酸小檗堿對照品溶液,由紫外吸收光譜圖可知鹽酸小檗堿在測定波長為230、265、349 nm處均有相當強度的吸收峰,,測定中曾采用265 nm波長處測定,但雜質峰干擾較大,分離效果不理想,影響測定,采用349 nm波長作為吸收波長,其分離效果好,檢測靈敏度高,可消除雜質峰的干擾。

3.2 流動相的選擇

實驗過程中,曾摸索多種流動相系統(tǒng)進行流動相的選擇。首先考察了甲醇-水流動相對鹽酸小檗堿分離的影響,分離效果不太理想,且峰形產(chǎn)生嚴重拖尾現(xiàn)象,均不能將鹽酸小檗堿與其他雜質較好分離。后改用乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀為流動相,并用磷酸調PH3.0,有較好的分離效果,鹽酸小檗堿的保留時間穩(wěn)定,且峰形有所改善,故選擇乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀并加入磷酸調p H3.0為流動相。

3.3 提取方法的的選擇

我們實驗中提取王氏保赤丸中鹽酸小檗堿,曾以索氏提取器提取并對比甲醇超聲提取效果,結果表明,超聲提取方法提取率高,效果好,超聲60 min可充分提取完成,故選用超聲提取法。

4 結論

我們采用HPLC法測定王氏保赤丸中鹽酸小檗堿的含量,鹽酸小檗堿在0.20μg～1.20μg范圍內線性關系良好,其線性方程為A=3 673.7m+5.525 1, r=0.999 9,平均回收率為100.49%,RSD=1.46% (n=9),且線性關系良好、準確度高、精密度好、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性均較好,可作為該產(chǎn)品含量測定的可靠方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[S].北京:化學工業(yè)出版社,2010:640.

[2]陳馥馨.新編中成藥手冊[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1991:103-104.

[3]黃馳,王旭敏.王氏保赤丸質量標準研究[J].中國藥科大學學報,1995,26(2):68-71.

[4]王小逸,史亦麗,曾衍鈞.小檗堿的研究進展[J].中國新藥雜志,2003,12(7):523.

[5]劉傳玲,董麗萍,叢永壯.HPLC法測定黃柏中小檗堿的含量[J].中國藥事,2005,19(6):383.

[6]祝晨陳,林朝展,莫建霞.HPLC法測定黃柏藥材中的小檗堿與黃柏堿的含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2004,15 (4):2 642-2 641.

[責任編輯 李武營]

Determination of the berberine hydrochloride in Wangshibaochi Pill by RP-HPLC

JINGYongsheng，LI Yanfang
（Pharmaceutical College of He Nan University，Kai Feng，Henan 475004，China）

Objective To establish a method for the determination of the berberine hydrochloride in Wangshibaochi Pill by RP-HPLC.Methods Diamonsil-C18column（250 mm×4.6 mm，5μm），acetonitrile-0.05 mol/LKH2PO3（28∶72）as mobile phase，adding phosphoric aci to make the p H value 3.0.The column temperature was room temperature，the flow rate was 1.0 m L·min-1，and the detection wavelength was 349 nm.Results The concentration of the berberine hydrochloride was linearly related to its peak area in the rang of 0.20～1.20μg，the linear regression equation is A=3 673.7m+5.525 1，r=0.999 9.The average recovery was 100.49%，with RSD of 1.46%（n=9）.Conclusion This method is linear、accurate、precise and stabile，it can be used for quality control of Wangshibaochi pills.

Wangshibaochi pills；berberine hydrochloride；RP-HPLC；Content determination

R927.2

A

1672-7606(2014)04-0250-03

2014-07-12

敬永升(1964-),男,河南駐馬店人,副教授,從事藥物分析科研及教學工作。