王璐，楊柳，任微，褚美玲，孟冬婭，薛文成

Br uke r B iotype r和Vitek MS系統(tǒng)質(zhì)譜分析鑒定革蘭陰性菌臨床分離株的比較研究

王璐，楊柳，任微，褚美玲，孟冬婭，薛文成

目的比較并評(píng)價(jià)兩種基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）系統(tǒng)——Bruker MALDIBiotyper系統(tǒng)（以下簡(jiǎn)稱Bruker Biotyper系統(tǒng)）和MALDITOFVitek MS系統(tǒng)（以下簡(jiǎn)稱Vitek MS系統(tǒng)）在革蘭陰性菌臨床分離株鑒定中的應(yīng)用。方法收集沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院2012年3月—2013年1月分離自血液、尿液、腦脊液、分泌物、傷口拭子和痰液臨床標(biāo)本的革蘭陰性菌共120株。應(yīng)用Vitek 2Compact生化鑒定系統(tǒng)將每株細(xì)菌鑒定到種，而后采用Bruker Biotyper和Vitek MS系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行鑒定，三者鑒定結(jié)果存在差異的菌株經(jīng)16S rDNA測(cè)序最終確認(rèn)菌種。結(jié)果對(duì)于120株革蘭陰性菌臨床分離株，Bruker Biotyper和Vitek MS系統(tǒng)在屬的水平上正確鑒定率分別為95.0%和92.5%，在種的水平上正確鑒定率分別為89.2%和86.7%，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論Bruker Biotyper和Vitek MS系統(tǒng)對(duì)革蘭陰性菌臨床分離株的正確鑒定率不存在差異，兩種系統(tǒng)的鑒定結(jié)果與各自的圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)有密切關(guān)系。

光譜法，質(zhì)量，基質(zhì)輔助激光解吸電離基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；圖譜；革蘭陰性菌

目前，中國(guó)大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室的細(xì)菌鑒定主要依靠常規(guī)生化反應(yīng)鑒定和表型鑒定，包括傳統(tǒng)手工法和自動(dòng)化儀器鑒定系統(tǒng)。傳統(tǒng)的鑒定方法既繁瑣又費(fèi)時(shí)，從細(xì)菌分離培養(yǎng)到鑒定結(jié)果報(bào)告，至少需要48～72 h，自動(dòng)化儀器鑒定提高了檢測(cè)效率，但通常也需要18～24 h發(fā)出報(bào)告。與其相比，分子學(xué)鑒定方法（如熒光雜交和PCR法）快速、準(zhǔn)確，但成本昂貴而且耗力，并不適合于常規(guī)大量樣本的鑒定。臨床醫(yī)師急需病原微生物的鑒定結(jié)果以明確感染源并進(jìn)行下一步治療，因此，微生物實(shí)驗(yàn)室開展一種簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確高效的微生物鑒定方法已成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。

本研究分別應(yīng)用德國(guó)Bruker Daltonics公司和法國(guó)bioMérieux公司的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laserdesorption ionization time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS）對(duì)分離自臨床標(biāo)本的120株革蘭陰性菌進(jìn)行鑒定，對(duì)檢測(cè)結(jié)果存在差異的菌株經(jīng)16S rDNA測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)，并對(duì)兩種質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較和評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源收集沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院2012年3月—2013年4月革蘭陰性菌臨床分離株120株（代表40個(gè)菌屬和81個(gè)菌種）。菌株來(lái)源：血液40株、痰液38株、尿液23株、分泌物10株、膿汁2株、腦脊液4株、糞便2株和傷口拭子1株。

1.2 主要儀器及試劑主要儀器及試劑包括BrukerMALDIBiotyper系統(tǒng)（Bruker Daltonics公司，德國(guó)）（以下簡(jiǎn)稱Bruker Biotyper系統(tǒng)）、MALDI-TOFVitek MS系統(tǒng)（bioMérieux公司，法國(guó)）（以下簡(jiǎn)稱Vitek MS系統(tǒng)）、Vitek 2 Compact自動(dòng)鑒定儀（bioMérieux公司，法國(guó)）、GN、NH和ANC細(xì)菌鑒定卡（bioMérieux公司，法國(guó)）、基因組DNA小量提取試劑盒及PCR反應(yīng)相關(guān)試劑（大連寶生物公司）以及Roche480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司，瑞士）。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)所有菌株標(biāo)本均接種在合適的培養(yǎng)基上（5%羊血瓊脂或巧克力培養(yǎng)基），于35℃孵育箱恒溫培養(yǎng)18～24 h（生長(zhǎng)條件有特殊要求的菌株置于5%～10%CO2培養(yǎng)箱或厭氧袋中）。每天觀察平板生長(zhǎng)狀況及菌落形態(tài)，18～24 h后對(duì)菌落進(jìn)行次代純培養(yǎng)。

1.4 Vitek 2Compact生化鑒定對(duì)純培養(yǎng)菌株進(jìn)行革蘭染色，嚴(yán)格按照Vitek 2 Compact系統(tǒng)操作程序及GN、NH和ANC細(xì)菌鑒定卡說(shuō)明書進(jìn)行操作。首先挑取純培養(yǎng)菌落，用0.45%無(wú)菌氯化鈉溶液配置成相應(yīng)濁度的菌懸液，然后應(yīng)用相應(yīng)卡片上機(jī)鑒定。

1.5 MALDI-TOF-MS系統(tǒng)鑒定

1.5.1 點(diǎn)樣用無(wú)菌接種環(huán)挑取適量（3～5個(gè)）純培養(yǎng)單個(gè)菌落涂在質(zhì)譜儀樣品檢測(cè)板上，迅速點(diǎn)樣0.5μl的甲酸覆蓋加樣的位置，隨后再點(diǎn)樣1μlα-氰基-4-羥基肉桂酸溶液覆蓋。室溫放置，待基質(zhì)液干燥后，將檢測(cè)板放入質(zhì)譜儀檢測(cè)。將質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC8739作為每一組的校準(zhǔn)靶點(diǎn)。

1.5.2 Bruker Biotyper系統(tǒng)結(jié)果判讀先通過(guò)MALDI-TOF-MS采集多肽和蛋白質(zhì)的譜峰，再按質(zhì)量大小排序形成特征的峰譜，即指紋圖，通過(guò)每種細(xì)菌獨(dú)特的蛋白組成來(lái)鑒定細(xì)菌，應(yīng)用于不同菌株的鑒定與區(qū)分。以線性正性模式用最大頻率（20～200Hz）采集相對(duì)分子質(zhì)量2～20 kDa的圖譜，用Biotyper軟件對(duì)所采集的譜圖進(jìn)行分析。當(dāng)Bruker Biotyper系統(tǒng)分值≥1.7時(shí)，認(rèn)為結(jié)果高度可信。

1.5.3 Vitek MS系統(tǒng)結(jié)果判讀先通過(guò)MALDITOF-MS獲得譜圖，然后與Vitek MS數(shù)據(jù)庫(kù)中不同微生物家族的種/屬特定譜圖相比對(duì)，從而得出鑒定結(jié)果。數(shù)據(jù)庫(kù)包含大量臨床相關(guān)細(xì)菌菌種，運(yùn)用專用計(jì)算方法增加細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確率。系統(tǒng)以線性正性模式用50 Hz頻率采集相對(duì)分子質(zhì)量2～20 kDa的圖譜，并采用先進(jìn)的ASC運(yùn)算法對(duì)所得譜圖進(jìn)行分析。根據(jù)所得譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)參考譜圖匹配程度，BioTyper軟件匹配模式可得到0～100的分值（對(duì)數(shù)值1～3），Vitek MS系統(tǒng)可得到0%～99.9%的數(shù)值，當(dāng)Vitek MS系統(tǒng)分值≥70%時(shí)，認(rèn)為結(jié)果高度可信。

1.6 16S rDNA檢測(cè)及測(cè)序細(xì)菌DNA提取采用大連寶生物有限公司DNA提取試劑盒（MiniBEST BacterialGenomic DNA Extraction KitⅡ），嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求進(jìn)行提取。16S rDNA基因擴(kuò)增嚴(yán)格按照試劑盒（TakaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit）說(shuō)明書進(jìn)行。PCR基因測(cè)序由大連寶生物有限公司測(cè)序部完成；測(cè)序后序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行在線比對(duì)。

1.7 鑒定結(jié)果判讀當(dāng)Bruker Biotyper、Vitek MS和Vitek 2Compact系統(tǒng)三者鑒定結(jié)果一致時(shí)，將此鑒定結(jié)果作為最終確認(rèn)菌種結(jié)果；當(dāng)三者鑒定結(jié)果有任何不一致，以16S rDNA基因測(cè)序結(jié)果為確認(rèn)結(jié)果。根據(jù)參考菌株和系統(tǒng)分值，將質(zhì)譜鑒定結(jié)果分類如下：①正確鑒定到種，即質(zhì)譜鑒定結(jié)果與參考菌株在種的水平上完全一致；②正確鑒定到屬，即質(zhì)譜鑒定結(jié)果與參考菌株在屬的水平上一致；③錯(cuò)誤鑒定，即質(zhì)譜鑒定結(jié)果與最終確認(rèn)菌株在屬的水平上不一致；④無(wú)法鑒定，當(dāng)Bruker Biotyper系統(tǒng)鑒定分值＜1.7，VitekMS系統(tǒng)鑒定分值＜70%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組間計(jì)數(shù)資料比較用四格表χ2檢驗(yàn)或連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 120株革蘭陰性菌臨床分離株鑒定結(jié)果對(duì)于本研究中的120株革蘭陰性菌臨床分離株，Bruker Biotyper和Vitek MS系統(tǒng)在屬的水平上正確鑒定率分別為95.0%（114株）和92.5%（111株），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.640，P=0.424）；二者在種的水平上正確鑒定率分別為89.2%（107株）和86.7%（104株），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.353，P=0.552）。見表1。

2.2 Bruker Biotyper或Vitek MS系統(tǒng)錯(cuò)誤鑒定或未鑒定出結(jié)果的菌株Bruker Biotyper和Vitek MS系統(tǒng)的鑒定結(jié)果與16S rDNA測(cè)序結(jié)果不符合率分別為5.0%（6株）和7.5%（9株）。Bruker Biotyper系統(tǒng)未鑒定出結(jié)果的菌株共有5株，包括銅綠假單胞菌1株，腦膜敗血性黃桿菌1株，普城沙雷菌1株，皮氏羅爾斯頓菌1株和衣氏放線菌1株，此外，Bruker Biotyper系統(tǒng)將1株水生拉恩菌鑒定錯(cuò)誤。Vitek MS系統(tǒng)未鑒定出結(jié)果的菌株共有8株，包括聚團(tuán)腸桿菌1株，雷極普羅威登菌1株，棲稻假單胞菌2株，放射根瘤菌1株，創(chuàng)傷弧菌1株，芳香類香味菌1株和衣氏放線菌1株，此外，Vitek MS系統(tǒng)將1株宋內(nèi)志賀菌鑒定錯(cuò)誤。對(duì)于研究中的1株衣氏放線菌二者均未鑒定出結(jié)果，歸因于這個(gè)菌種并不存在于二者的數(shù)據(jù)庫(kù)中。

表1 Bruker Biotyper和Vitek MS系統(tǒng)的鑒定結(jié)果(株)Table 1 Results of identification by Bruker Biotyper system and Vitek MS system(isolates)

3 討論

近年來(lái)，MALDI-TOF-MS作為一種新興的微生物鑒定技術(shù)，得到眾多研究的認(rèn)可[1-14]。與傳統(tǒng)生化表型鑒定和分子生物學(xué)鑒定方法相比，以MALDITOF-MS為基礎(chǔ)的鑒定系統(tǒng)是一種準(zhǔn)確快速、經(jīng)濟(jì)有效的微生物鑒定系統(tǒng)[5，9-11]。將MALDI-TOF-MS與實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)和其他自動(dòng)化設(shè)備連接起來(lái)，以此而形成的多種鑒定方法正在應(yīng)用或發(fā)展中[12]。現(xiàn)今，一些操作簡(jiǎn)易的商業(yè)化質(zhì)譜儀已經(jīng)在常規(guī)微生物鑒定中得到應(yīng)用，例如德國(guó)Bruker Daltonics公司的Burker Biotyper系統(tǒng)、法國(guó)bioMérieux公司的Vitek MSRUO和Vitek MS系統(tǒng)以及法國(guó)SAS公司的Andromas檢測(cè)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)擁有不同的圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)和獨(dú)特的數(shù)據(jù)分析計(jì)算法則[15]，因其鑒定的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)已廣泛應(yīng)用于臨床細(xì)菌鑒定的工作中。

早期研究認(rèn)為質(zhì)譜儀對(duì)非發(fā)酵菌[16]、沙門菌[17]等很多細(xì)菌的鑒定準(zhǔn)確率近乎100%。而本研究中對(duì)某些非發(fā)酵菌的鑒定中存在未被鑒定出結(jié)果的現(xiàn)象，如Bruker Biotyper系統(tǒng)在1株銅綠假單胞菌和1株腦膜敗血性黃桿菌的鑒定中未鑒定出結(jié)果，而Vitek MS系統(tǒng)在2株棲稻假單胞菌和1株芳香類香味菌的鑒定中未鑒定出結(jié)果，原因可能在于質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)這些菌株。國(guó)內(nèi)有研究報(bào)道，利用MALDI-TOF-MS對(duì)包括腸桿菌科細(xì)菌、嗜血桿菌及非發(fā)酵菌在內(nèi)的9種180株革蘭陰性菌進(jìn)行鑒定，符合率達(dá)到96.7%[18]，略高于本次研究，可能因其涵蓋的陰性菌種類明顯少于本次研究。

本研究中的120株革蘭陰性菌臨床分離株包括40個(gè)菌屬和81個(gè)菌種，囊括了臨床工作中絕大多數(shù)的革蘭陰性桿菌，對(duì)大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌，兩種質(zhì)譜儀都能進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。對(duì)于衣氏放線菌，由于二者數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在此菌種，因此都未能鑒定出來(lái)。有些菌株在首次檢測(cè)中無(wú)法被鑒定，但經(jīng)2～3次重復(fù)檢測(cè)后，部分菌株能得到準(zhǔn)確鑒定，這表明操作者和樣品準(zhǔn)備等質(zhì)譜分析前階段因素有可能會(huì)影響鑒定結(jié)果[2-3，13]，例如菌株重復(fù)傳代培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致其無(wú)法被鑒定。因此，在常規(guī)工作中應(yīng)該對(duì)首次無(wú)法鑒定的菌株進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。而那些雖然包含在數(shù)據(jù)庫(kù)中但在重復(fù)檢測(cè)中依然未被鑒定出來(lái)的菌株，很可能是由于其產(chǎn)生的圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中的特征圖譜不一致。

Couturier等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，使用Bruker固有的數(shù)據(jù)庫(kù)，93%的菌株至少能被鑒定到屬的水平，只有66%的菌株能被鑒定到種的水平。而通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行自定義補(bǔ)充后，所有的菌株能被鑒定到屬的水平，79%的菌株能被正確鑒定到種的水平。研究者把上述現(xiàn)象歸結(jié)于：儀器生產(chǎn)商數(shù)據(jù)庫(kù)中生物個(gè)體單一的參考光譜并不能代表其他實(shí)驗(yàn)室分離的典型菌株，也就是說(shuō)菌株的多樣性影響了鑒定的準(zhǔn)確性。因此，數(shù)據(jù)庫(kù)中較多的參考光譜可使鑒定結(jié)果更為可靠?？梢姡瑘D譜數(shù)據(jù)庫(kù)的組成和質(zhì)量對(duì)質(zhì)譜儀的正確鑒定至關(guān)重要，這與本研究結(jié)果基本一致。

針對(duì)單一的MALDI-TOF-MS鑒定系統(tǒng)和傳統(tǒng)鑒定方法進(jìn)行比較的研究較多，直接對(duì)兩種MALDI-TOF-MS系統(tǒng)進(jìn)行比較和評(píng)估的研究還較少。Chen等[20]報(bào)道了BrukerBiotyper和VitekMSIVD系統(tǒng)采用MALDISepsityper蛋白質(zhì)提取法對(duì)181株（代表20個(gè)菌屬和40個(gè)菌種）來(lái)自血培養(yǎng)物的細(xì)菌的直接鑒定，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，P=0.016，總體上Bruker Biotyper系統(tǒng)（97.8%）的正確鑒定水平高于Vitek MSIVD系統(tǒng)（92.3%）。

為提高M(jìn)ALDI-TOF-MS對(duì)細(xì)菌的鑒定能力，儀器制造商有必要對(duì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)逐步完善，使其涵蓋盡量多的菌屬和菌種。此外，考慮到菌株標(biāo)本來(lái)源多樣性、地域來(lái)源差異性和不同分離年限，數(shù)據(jù)庫(kù)中應(yīng)包含同一個(gè)菌種采集的多個(gè)分離株的圖譜，并允許用戶將本地分離的典型菌株作為參考菌株填充到自定義數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行最有效的補(bǔ)充，以便更大地發(fā)揮其鑒定作用。

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（2014-07-22收稿 2014-09-03修回）

（責(zé)任編委 曲 芬 本文編輯 王 姝）

Com parison of Bruker Biotyper system and Vitek MS system in the identification of clinical Gram-negative isolates

WANG Lu,YANG Liu,RENWei,CHU Mei-ling,MENG Dong-ya,XUEWen-cheng*
Department of Laboratory,General Hospital of Shenyang Military Area Command,Shenyang,Liaoning 110016,China
*Corresponding author,E-mail:13309884078@189.cn

Objective To compare and evaluate the use of twomatrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry(MALDI-TOF-MS)systems,Bruker MALDIBiotyper system(Bruker Biotyper system)and MALDI-TOF Vitek MS system(Vitek MS system)in the identification of Gram-negative clinical isolates.Methods A total of 120 Gram-negative isolates were collected from blood,urine,cerebrospinal fluid,secretion,wound swab and sputum samples from patients treated in General Hospital of Shenyang Military Area Command from Mar.2012 to Jan.2013.Each isolate was firstly identified to the species by Vitek 2 Compact system,and then identified by Bruker Biotyper system and Vitek MSsystem.Isolates differently identified by the three systemswere finally confirmed by 16S rDNA sequencing as the gold standard.Results Of the 120 isolates,95.0%were correctly identified to thegenus levelby Bruker Biotyper system and 92.5%by Vitek MSsystem,and 89.2%were correctly identified to the species level by Bruker Biotyper system and 86.7%by Vitek MSsystem,and the differencesbetween them were notsignificant.Conclusions Bruker Bio-typersystem and Vitek MSsystem were notsignificantly different in the accuracy ratesof identifying clinicalGram-negative isolates. In addition,the identification resultsof the two systemsare closely related to theirown databasesofpictorialworks.

spectrometry,mass,matrix-Assisted laser desorption-ionization;pictorialworks;Gram-negative bacteria

R313

A

1007-8134(2014)05-0282-05

110016，沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科（王璐、楊柳、任微、褚美玲、孟冬婭、薛文成）

薛文成，E-mail:13309884078@189.cn