張永旺 武振華 馮少勇 柯鑫文 張雁鋼

前列腺癌（PCa）是老年男性的常見(jiàn)疾病。PCa在歐美地區(qū)占男性惡性腫瘤首位，是導(dǎo)致發(fā)達(dá)國(guó)家男性癌死亡的主要原因[1]。我國(guó)PCa發(fā)病率較歐美低，但近年來(lái)，我國(guó)PCa的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。目前，血清前列腺特異性抗原（PSA）作為PCa的單一檢測(cè)指標(biāo)，雖然具有較高的PCa陽(yáng)性診斷預(yù)測(cè)率，但它受到年齡、前列腺按摩、穿刺、感染、藥物等因素的影響，致使其診斷的敏感性、特異性不高，不能充分滿足臨床需要，因此，PCa急需要敏感特異的生物標(biāo)記物。

腫瘤是多因素參與、多基因變異積累、多階段發(fā)生的復(fù)雜的病理過(guò)程。PCa的發(fā)病機(jī)制尚未明確，探索PCa的發(fā)病機(jī)制，將為PCa的早期診斷與治療提供理論依據(jù)。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的主要修飾方式之一，在基因表達(dá)的調(diào)控、基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定等方面有重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PCa的臨床分期與DNA甲基化密切相關(guān)，甲基化往往發(fā)生在腫瘤的早期，且甲基化頻率隨著疾病的進(jìn)展而增高[3]。通過(guò)筆者對(duì)國(guó)內(nèi)外PCa的甲基化研究文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，同時(shí)參考Ahmed[4]對(duì)PCa生物標(biāo)記基因的預(yù)測(cè)。筆者預(yù)測(cè)GSTP1和RASSFIA最有可能成為PCa的早期生物標(biāo)記，同時(shí)也有可能為疾病的預(yù)后提供更多提示。本研究旨在采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）方法檢測(cè)PCa組織和前列腺增生（BPH）組織中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶1（GSTP1）和RAS相關(guān)區(qū)域家族1（RASSF1）基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化改變；采用免疫組化SP染色法檢測(cè)PCa組織和BPH組織中GSTP1和RASSF1的蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步研究GSTP1和RASSF1A基因異常甲基化及靶蛋白的表達(dá)情況，探討GSTP1和RASSFIA基因甲基化作為PCa早期診斷的價(jià)值及在PCa中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院病理科PCa組織石蠟標(biāo)本及BPH組織石蠟標(biāo)本，分別進(jìn)行組織DNA甲基化檢測(cè)及免疫組化。其中經(jīng)前列腺根治手術(shù)切除的PCa組織石蠟標(biāo)本50例，患者年齡為51-82歲，平均（65.72±9.09）歲；BPH組織石蠟標(biāo)本30例，患者年齡52-83歲，平均（66.13±10.23）歲。所有樣本均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)，且PCa患者術(shù)前均未進(jìn)行化療或放療治療。

1.2 主要試劑和儀器 OMEGA FFPE DNA Kit（50）；Realtime PCR Master Mix；EpiTect Bisulfite Kits（48）；EpiTect Control DNA（100）；2×NI-Taq PCR MasterMix；鼠抗人GSTP1單克隆抗體、鼠抗人RASSF1A單克隆抗體；全自動(dòng)酶標(biāo)儀DG3022A型；PCR儀Applied Biosystems；凝膠成像系統(tǒng)AlphaImager HP。

1.3 方法

1.3.1 MSP方法 根據(jù)文獻(xiàn)[5-6]設(shè)計(jì)引物，具體序列如表1所示，ACTB引物參考文獻(xiàn)；所有引物由Invitrogen公司合成。

PCa組織BPH組織分別進(jìn)行DNA常規(guī)提取。提取的DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280比值在1.7~20之間的為合格標(biāo)本，計(jì)算標(biāo)本DNA濃度，按亞硫酸鹽處理試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行DNA甲基化修飾；取約50 ng亞硫酸處理后DNA作為模板，以NEB公司2×NI-Taq PCR MasterMix作為原料，以ACTB為內(nèi)參，應(yīng)用PCR儀器（Applied Biosystems）進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。每次反應(yīng)均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，空白對(duì)照（雙蒸水為陰性對(duì)照），每個(gè)樣本重復(fù)3次。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性 30 s，53/58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，45個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸15 min。然后在3%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結(jié)束后，采用凝膠成像系統(tǒng)成像，分析結(jié)果。

表1 GSTP1和RASSF1A基因甲基化與非甲基化引物序列

1.3.2 免疫組織化學(xué)方法 PCa和BPH石蠟組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后，放入3%雙氧水-甲醇溶液中浸泡10 min，以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，經(jīng)高壓抗原熱修復(fù)之后，滴加抗體（詳細(xì)步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行），經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染。每批染色用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。顯微鏡下觀察，結(jié)果采用半定量計(jì)分法判斷，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)打分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%~25%為1分，26%~50%為2分，51%~75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度打分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再由陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度的乘積判斷陽(yáng)性等級(jí)：0~2分為陰性（-），3~8分為弱陽(yáng)性（+），9~12分為強(qiáng)陽(yáng)性（++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用 字2檢驗(yàn)對(duì)GSTP1及RASSF1A基因在PCa與BPH組織中的甲基化率進(jìn)行比較分析，同時(shí)采用相同的方法對(duì)靶蛋白的陽(yáng)性強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSP法檢測(cè)結(jié)果比較 采用MSP法對(duì)50例PCa組織和30例BPH組織中的GSTP1基因及RASSF1A基因進(jìn)行甲基化檢測(cè)，50例PCa組織中GSTP1基因及RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化例數(shù)分別為38例和34例，甲基化率分別為76.00%和68.00%。30例BPH組織中，GSTP1基因及RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化例數(shù)分別為1例和5例，甲基化率分別為3.33%和16.67%，見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，PCa組織中GSTP1基因及RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化頻率均明顯高于BPH組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

表2 PCa組織和BPH組織中GSTP1和RASSF1A基因的甲基化檢測(cè)結(jié)果比較 例

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果比較 采用SP染色法對(duì)50例PCa組織和30例BPH組織中的GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白進(jìn)行檢測(cè)，50例PCa組織中GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白陽(yáng)性反應(yīng)的例數(shù)分別為10例和19例，陽(yáng)性率分別為20.00%和38.00%。30例BPH組織中GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白陽(yáng)性反應(yīng)的例數(shù)分別為23例和27例，陽(yáng)性率分別為76.67%和90.00%，見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白在PCa組織中的表達(dá)均明顯低于BPH組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

表3 GSTP1和RASSF1A基因在PCa組織和BPH組織中的表達(dá)比較 例

3 討論

DNA甲基化是一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，它通過(guò)甲基化使抑癌基因和相關(guān)保護(hù)基因沉默，致使靶蛋白表達(dá)缺失，促進(jìn)了PCa的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過(guò)對(duì)GSTP1和RASSF1A基因在PCa組織中的甲基化檢測(cè)及其靶蛋白表達(dá)研究，分析探討GSTP1和RASSF1A基因甲基化在PCa的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。GSTP1基因定位于染色體11q13，GSTP1參與代謝、解毒和消除潛在的具有基因毒性的外來(lái)復(fù)合物，它能夠代謝多種致癌化合物，起到保護(hù)細(xì)胞避免DNA損傷和癌細(xì)胞形成的作用，抑制GSTP1活性可以導(dǎo)致DNA損傷的敏感性增強(qiáng)和癌變發(fā)生的幾率增加。筆者對(duì)GSTP1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)顯示：PCa與BPH相比，GSTP1甲基化頻率較高；這說(shuō)明GSTP1在正常前列腺組織中以非甲基化形式存在，在PCa中多以高甲基化形式存在。結(jié)合免疫組化結(jié)果：GSTP1在正常前列腺上皮多呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性或陽(yáng)性反應(yīng)，而在PCa惡性上皮多呈陰性反應(yīng)。結(jié)合以上研究，說(shuō)明在BPH組織中GSTP1高表達(dá)而在PCa組織細(xì)胞中存在GSTP1低表達(dá)或表達(dá)缺失。研究提示在PCa中GSTP1啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)致了靶蛋白表達(dá)降低甚至缺失，促進(jìn)PCa的發(fā)生發(fā)展。

RASSF1A是Dammann等[6]與2000年發(fā)現(xiàn)的一種新型的抑癌基因，該基因的表達(dá)失活在人類多重腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。然而基因突變、缺失及DNA啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化均可能導(dǎo)致RASSF1A基因的失活，人類腫瘤中的RASSF1A表達(dá)缺失是一個(gè)普遍事件，至少在37種腫瘤中存在RASSF1A啟動(dòng)子的異常甲基化[7-8]。現(xiàn)已有關(guān)于該基因的表達(dá)及其甲基化的檢測(cè)報(bào)道[9-11]。筆者對(duì)RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)顯示：PCa組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率明顯高于BPH，但是BPH中也有部分甲基化的發(fā)生。說(shuō)明RASSF1A在PCa發(fā)生進(jìn)展的過(guò)程中，RASSF1A基因的甲基化頻率逐步增高。免疫組化方面：RASSF1A在BPH組織中的表達(dá)明顯高于PCa組織，癌組織RASSF1A蛋白表達(dá)明顯降低或缺失。結(jié)合上述兩種方法，筆者認(rèn)為RASSF1A基因啟動(dòng)子高甲基化可能造成該基因表達(dá)降低或失活，導(dǎo)致靶蛋白表達(dá)減少或缺失。這樣的結(jié)果提示，RASSF1A基因可作為PCa早期診斷的分子標(biāo)記物，同時(shí)為PCa的臨床分期提供依據(jù)。

通過(guò)對(duì)GSTP1和RASSF1A基因的研究，筆者發(fā)現(xiàn)DNA啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化的發(fā)生致使蛋白低表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致PCa的發(fā)生和進(jìn)展。本研究中GSTP1基因的研究結(jié)果與國(guó)外Ellinger[12]報(bào)道結(jié)果基本一致，而與國(guó)內(nèi)張彥等[13]研究結(jié)果不盡相同，這種差異的存在可能與樣本量、實(shí)驗(yàn)方法或地域不同等因素有關(guān)，也有可能為樣本有PCa和BPH組織并存、混雜等因素，因此檢測(cè)GSTP1和RASSF1A基因甲基化作為PCa早期診斷的分子標(biāo)記物，仍需進(jìn)一步的擴(kuò)大樣本含量、改變實(shí)驗(yàn)方法或擴(kuò)大研究范圍來(lái)研究證實(shí)。

目前，在其他腫瘤中，遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的改變已經(jīng)應(yīng)用于臨床。PCa也需要新的檢測(cè)和治療方法。以上結(jié)果表明，在PCa的發(fā)生和發(fā)展中，GSTP1和RASSF1A最有可能成為PCa的早期生物標(biāo)記，同時(shí)也將為PCa的診斷、治療、預(yù)后提供重要價(jià)值。

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