葉曉萍

（惠州學院 化學工程系，廣東 惠州 516007）

引言

消栓通絡片是由川芎、丹參、黃芪、澤瀉、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂十一味中藥組成，具有活血化瘀，溫經(jīng)通絡功效【1-2】。君藥川芎、丹參、郁金中含有水溶性酚酸類化合物［3-5］，其中原兒茶醛和咖啡酸具有廣泛的抑菌、抗病毒、擴張心腦血管、抗血小板凝集作用，原兒茶醛清除氧自由基等作用較二萜醌類的丹參酮更強。消栓通絡片的非水溶性成分含量指標已有報道［6-7］，但水溶性成分含量指標至今沒此方面的質(zhì)量標準。茍小鋒等用電化學色譜法對此進行了研究［8］，但方法復雜且儀器昂貴。本研究利用TLC與PHLC，對消栓通絡片中主要水溶性藥效成分的提取及定性、定量方法進行了研究，結(jié)果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器、藥品

AgiLent1100液相色譜儀(安捷倫，紫外檢測器)；5HU系列超聲波清洗器(天津恒奧科技)；HL—01溶劑過濾器；高速離心機；PHS-3C酸度計；LD－10LG－E1超純水機。

咖啡酸、原兒茶醛（Sigma公司），甲醇（色譜純））；消栓通絡片（黑龍江天宏藥業(yè)，批號：20060201），乙醇、醋酸乙酯、乙醚、甲酸、甲苯、三氯化鐵、醋酸碳酸鈉（分析純）川芎、丹參、黃芪、澤瀉、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂（同仁堂）。

1.2 供試品溶液的提取

取消栓通絡片10片，去包衣研碎，加乙醇25mL，超聲30min，放冷過濾，濾液蒸干。殘渣加15mL水溶解，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至2～3，加適量醋酸乙酯，超聲波提取3次，每次15mL，合并醋酸乙酯提取液，再用2%碳酸鈉溶液超聲波提取3次，每次10mL，合并碳酸鈉提取液，用水飽和的乙醚20mL洗滌，棄去乙醚液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值至2～3，用乙醚超聲波提取3次，每次15mL，合并乙醚提取液，揮干，殘渣加無水乙醇1.0mL溶解后，作為供試品溶液1#，用于薄層色譜（TLC）定性分析。

取本品20片，去包衣，研細，稱重為2.0563g，加入甲醇10.0mL，稱重后超聲提取4次，每次1h，靜置過夜后用甲醇補足減失的重量，在3000r.min-1下離心15min，吸取上清液5.0mL于10mL量瓶中，甲醇定容，微孔濾膜過濾，即得供試品溶液2#，用于高效液相（HPLC）定量定性分析。

取本品5片，除去包衣，研碎，加甲醇30mL，超聲30分鐘，放冷過濾，濾液蒸干，殘渣加水15mL使溶解，用醋酸乙酯振搖提取2次，每次15mL，合并醋酸乙酯提取液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液3#質(zhì)，TLC定性分析和HPLC定量定性分析。

1.3 對照品溶液的制備

取兩份原兒茶醛對照品適量，一份加入無水乙醇制成質(zhì)量濃度為0.5000g.L-1原兒茶醛對照品溶液1#用于TLC定性分析；一份加入甲醇制成質(zhì)量濃度為0.0803g.L-1原兒茶醛對照品2#溶液，再取咖啡酸對照品加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.0200g.L-1的咖啡酸對照品溶液，兩者均用于HPLC定量定性分析。

1.4 陰性樣品溶液的提取

按方抓取川芎、黃芪、澤瀉、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂十味藥材，將冰片和三七各粉碎成細粉；其余八味加水煎煮三次，合并煎液，過濾，濾液水浴濃縮成清膏，加入三七粉，烘干，制成粉末，干燥，再加入冰片粉，混勻，即得陰性樣品粉未。將陰性樣品粉未按供試品溶液1#制法制成陰性樣品溶液1#，用于TLC定性分析。再取陰性樣品粉末約2g照供試品溶液2#的提取制備方法制備成陰性樣品溶液2#，HPLC定量定性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 TLC法的定性鑒別

吸取1.2～1.4項下的所有1#溶液各10mL，在25oC、濕度65%下分別點于同一硅膠G薄板上，以甲苯：醋酸乙酯：甲酸（10：5：0.5）為展開劑，展開后取出晾干，噴以1%三氯化鐵-乙醇溶液，熱風吹至斑點顯色清晰，如圖1。從圖1知，各成份斑點清晰、分離度好。在供試品色譜A與對照品色譜B相應的位置上，顯相同顏色的斑點，但在與陰性樣品色譜C相應位置上未發(fā)現(xiàn)任何斑點；吸取供試品溶液3#、咖啡酸對照品和陰性對照品溶液1#各5mL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸丁酯-甲酸-水（7：2.5：2.5）為展開劑，展開，取出晾干，置紫外燈光（365nm）下檢視。結(jié)果表明，展開顯色后，各有效成份斑點清晰、分離度好。在供試品色譜中與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而在陰性樣品色譜中相應位置上未發(fā)現(xiàn)任何斑點（圖略）。說明消栓通絡片中含有原兒茶醛、咖啡酸，且來都自于丹參，無陰性干擾。

Fig.1 TLC chromatograms of XiaoShuanTongLuo tabLets（A），protocatechuaLdehyde reference substances（B）and Negative sampLes withouts Danshen（c）

2.2 HPLC法對消栓通絡片定量方法

2.2.1 流動相的選擇

在波長為280nm下，分別在0.1%～2.5%冰醋酸：甲醇＝85：15的六種流動相下測定對照品溶液2#。結(jié)果原兒茶醛的保留時間隨酸度增大依次縮短，峰的對稱度增大；在波長為320 nm下，以不同配比的甲醇：水：冰乙酸：三乙胺配為流動相，測咖啡酸對照品溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在流動相中加入三乙胺可使峰的對稱度、分離度增大，而咖啡酸的保留時間隨酸度增大依次縮短。兩種系列都與C18柱的特點相結(jié)合考慮，最終選2.0%冰醋酸：甲醇＝85：15和甲醇：水：冰乙酸：三乙為11：89：2.0：0.3為流動相。

2.2.2 柱溫的選擇

吸取對照品2#溶液10μL，在30℃～45℃下測定（圖2）。由圖2知40℃為最佳柱溫。同樣，咖啡酸對照品溶液10μL上述相同之處溫度下測定，結(jié)果是30℃時最佳（圖略）。

圖2不同柱溫下的原兒茶醛對照品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances of coLumn temperature at 30℃（A），40℃（B）and 45℃（C）

2.2.3 流速的選擇

在流速為0.6～1.0(mL.min-1)下測試對照品2#溶液，發(fā)現(xiàn)它們的出峰時間漸短，考慮到消栓通絡片成分的復雜性及原兒茶醛要與其它成分有效分離等因素，確定流速為0.8mL.min-1，保留時間為10.963。同理測定咖啡酸對照品溶液的最佳流速為0.8mL.min-1，其保留時間為22.398min。

2.2.4 干擾性分析

吸取上述所有2#溶液，在原兒茶醛的色譜條件下測定，原兒茶醛對照品譜圖見圖2中A圖，樣品及陰性樣品圖見圖3。對比圖3和圖2（A），可確定譜圖3-A中保留時間為10.963的峰為原兒茶醛，而圖3-B中，原兒茶醛的保留時間內(nèi)沒有出峰。同樣，分別吸取上述咖啡酸對照品溶液、供試品溶液2#及陰性樣品溶液2#，在咖啡酸的色譜條件下測定，得圖4。觀察圖4，可確定圖4-B中保留時間為22.398 min的峰為咖啡酸，而圖4-C中，在咖啡酸的保留時間內(nèi)沒有出峰。綜上進一步說明原兒茶醛和咖啡酸來自丹參，藥中其它成分無干擾，與相鄰的雜質(zhì)分離好。

圖3 供試品（A）陰性樣品（B）液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms XiaoShuanTongLuo tabLets sampLe（B）and Negative sampLes withouts Danshen（c）

2.2.5 標準曲線的繪制

分別吸取原兒茶醛對照品2#溶液及咖啡酸對照品溶液各0.5、1、2、3、4、5、6、15、20μL，測定峰面積，外標峰面積法得原兒茶醛回歸方程y=434314x+18625，在0.040～1.606μg內(nèi)呈線性；咖啡酸為y=200580x+15672，在0.010～0.400μg內(nèi)呈線性，相關系數(shù)均為0.9998。

2.2.6 供試品中原兒茶醛及咖啡酸含量的測定

取20片藥品，按1.2項下供試品溶液2#制備方法制備，吸取10μL溶液測定，得原兒茶醛含量為0.109 mg.g-1即0.011 mg/片，RSD=1.09% ，咖啡酸的含量為0.121 mg.g-1，即0.012 mg/片，RSD=0.85%，（n=3）。

2.2.7 精密度試驗，穩(wěn)定性試驗

分別吸取對照品溶液2#和咖啡酸對照品溶液各20μL，在各自色譜條件下重復測定5次，原兒茶醛的RSD=0.12%，咖啡酸的RSD=0.57%；同理在0～48h內(nèi)每間隔3h測定供試品溶液2#一次，以便考查方法的穩(wěn)定性，結(jié)果原兒茶醛的RSD=1.22%，咖啡酸的RSD=0.53%。

2.2.8 加樣回收率試驗

精密移取供試品2#溶液各100μL，分別加入已加濃度為160.6ug.mL-1的原兒茶醛對照品及200.0ug.mL-1的咖啡酸對照品溶液各12μL，混勻，按2.2.6法測定，計算原兒茶醛平均回收率為100.46%，RSD=0.97%（n=5），咖啡酸平均回收率為99.84%，RSD=0.08%（n=5）。

3 結(jié)論

3.1 原兒茶醛具有酸性，在中性流動相中因存在著離解平衡，使其色譜峰嚴重的拖尾現(xiàn)象，加入少量醋酸可抑制其離解，減少拖尾。

3.2 采用薄層色譜法，以原兒茶醛為檢測指標時，考慮了不同醇沉濃度對原兒茶醛提取的影響。結(jié)果表明，用濃度為50%～60%的醇沉原兒茶醛損失較小，但用水作提取溶媒更有利于原兒茶醛的溶出，不過僅超聲30min提取原兒茶醛并不完全，而浸泡有利于原兒茶醛的溶出。即原兒茶醛水溶性成分提取工藝為：用水浸泡過夜再提取。溶劑pH對水溶性成分提取的有影響：隨著PH值升高，原兒茶醛含量顯著降低，在PH 9.2時已很微量；這表明，溶劑PH值是影響原兒茶醛提取效果的一個非常重要的因素。

3.3 本實驗的TLC和HPLC法的專屬性強，二者能相互印證說明藥中其它成分對分離測定無干擾，消栓通絡片中的主要水溶性藥效原兒茶醛、咖啡酸均來自于丹參，川芎、郁金中不含有，所以工廠在生產(chǎn)時一定要注意丹參的采購質(zhì)量及其加工提取過程中的工藝控制。此研究方法簡便可行，快捷，準確度及靈敏度高，可用于工廠及藥監(jiān)部門做為質(zhì)量標準。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京：化學出版社，2000，568-569.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京：化學出版社，2005，580-5819.

［3］王文祥，顧明，蔣小崗，等.川芎化學成分研究［J］.中草藥雜志，2002，33（1）：4.

［4］吳志軍，歐陽明安，楊崇仁.大紫丹參的多酚類化合物［J］..云南植物研究，1999，21（4）：512.

［5］易進海，陳燕，李伯剛，等.郁金化學成分的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15（2）：98.

［6］葉曉萍，駱小偉，吳仲夏，等.消栓通絡片中主要藥效成分質(zhì)量控制［J］.鄭州大學學報;自然科學版，2009.41（4）;89-92.

［7］朱麗萍，反相高效液相色譜法測定消栓通絡片中蘆丁含量［J］.中國藥業(yè)，2009，18（23）：26-27.

［8］茍小鋒，索志榮，曹煒，等.消栓通絡片中3種酚酸的高效液相色譜電化學檢測［J］.藥物分析雜志，2005，25（10）：1215-1218.