馮 曉 潘 峰 張臘紅 樓洪萍 張邢煒 陳兆軍

杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院，浙江杭州 310015

高血壓的嚴(yán)重程度與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害程度呈正相關(guān)，作為前體細(xì)胞，內(nèi)皮祖細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖、分化潛能，參與損傷內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)、維持血管穩(wěn)定，因此對(duì)于防止動(dòng)脈粥樣硬化及再狹窄具有重要意義[1-2]。血管生成素-1（Ang-1）及其酪氨酸激酶受體Tie2是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子，廣泛表達(dá)于內(nèi)皮祖細(xì)胞上，對(duì)于調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能具有重要意義[3-4]。本研究通過(guò)不同分級(jí)的原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞Ang-1/Tie2的表達(dá)變化，探討Ang-1/Tie2信號(hào)通路在修復(fù)與逆轉(zhuǎn)疾病發(fā)展中的重要價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院2012年1月～2013年6月住院的原發(fā)性高血壓患者45例為觀察組，其中男 23例，女 22例；年齡 38～71歲，平均（54.35±6.58）歲；依據(jù)WHO/ISH對(duì)高血壓的診斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰ級(jí)[血壓（145～159）/（90～99）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）]、Ⅱ級(jí)[血壓（160～179）/（100～109）mm Hg]和Ⅲ級(jí)[血壓≥180/110 mm Hg]高血壓患者，各15例。選擇同時(shí)期正常體檢人群30名為對(duì)照組，男女各15名；年齡 39～70 歲，平均（53.64±6.17）歲。 各組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。剔除糖尿病、潰瘍、外傷、近期外科手術(shù)、腫瘤、炎癥等影響內(nèi)皮祖細(xì)胞疾病的患者以及近3個(gè)月無(wú)急性心肌梗死、心絞痛發(fā)生患者。

1.2 方法和試劑

1.2.1 主要試劑和儀器

QIAGEN RNA提取試劑盒（基因公司），RT-PCR試劑盒與引物合成（武漢博士得生物工程有限公司），PCR儀 （德國(guó) Biometra公司）；DNA Marker DL2000（大連 TaKaRa公司）。Control Primer：β-actin（532 bp）；Ang-1 基因 （312 bp） 引物：5′-TCCGGTGAATATTG GCTGGG-3′，5′-AAATCGCTGTCTGATCTTCTTCCAT-3′；Tie2 （512 bp）引物：5′-ATGGACTCTTTAGCCGGCTTA-3′，5′-CCTTATAGCCTGTCCTCGAA-3′。 總蛋白提取試劑盒SBS（Genetech公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS，MERCK公司）；抗人Tie2酪氨酸磷酸化抗體、抗人β-actin抗體以及HPR標(biāo)記的二抗均來(lái)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 治療方法

針對(duì)Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)高血壓患者采取常規(guī)降壓方案，主要包括β受體阻斷劑、鈣離子拮抗劑、阿司匹林以及他汀類藥物，連續(xù)使用4周，所有患者治療后血壓均達(dá)到130/80 mm Hg以下。

1.2.3 Ang-1和Ti e2水平測(cè)定

所有研究對(duì)象入選前1周內(nèi)未服用任何降壓藥和抗氧化劑，清晨分別抽取空腹外周血20 mL置入無(wú)菌肝素抗凝管內(nèi)，加入Ficoll液4℃離心分離單個(gè)核細(xì)胞層并采用差速貼壁法純化內(nèi)皮祖細(xì)胞。

1.2.3.1 采用RT-PCR法測(cè)定Ang-1和Tie2 mRNA水平 分別提取各組內(nèi)皮祖細(xì)胞總RNA，合成cDNA：加入總 RNA 2μg，oligo dT 1μL，RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μL，無(wú)RNA去離子水共20μL，輕輕混勻后，70℃變性5 min，42℃ 2 h，冰浴。分管進(jìn)行Ang-1、Tie2和 β-actin基因PCR，95℃ 5 min，94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)，72℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)圖像分析儀進(jìn)行灰度分析，分別測(cè)定Ang-1/β-actin以及Tie2/β-actin灰度比值。

1.2.3.2 采用Western-blot法測(cè)定Tie2酪氨酸磷酸化水平 分別提取各組內(nèi)皮祖細(xì)胞總蛋白后取20μg，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃轉(zhuǎn)膜12 h，蛋白封閉，加入抗Tie2酪氨酸磷酸化一抗、二抗，顯影、壓片。膠片經(jīng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)得Tie2磷酸化/β-actin光密度比值反映體內(nèi)活化Tie2受體表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組內(nèi)皮祖細(xì)胞 Ang-1、Tie2 mRNA表達(dá)和Tie2酪氨酸磷酸化水平比較

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ⅲ級(jí)高血壓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞Ang-1和Tie2 mRNA表達(dá)分別顯著低于Ⅱ、Ⅰ級(jí)高血壓患者和對(duì)照組（P＜0.05）；Ⅱ級(jí)高血壓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞Ang-1和Tie2 mRNA表達(dá)低于Ⅰ級(jí)高血壓患者和對(duì)照組（P＜0.05）。內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)受體蛋白水平：Ⅲ級(jí)高血壓患者活化Tie2水平明顯低于Ⅱ、Ⅰ級(jí)高血壓患者和對(duì)照組（P＜0.05）；Ⅱ級(jí)高血壓患者Tie2磷酸化水平低于Ⅰ級(jí)高血壓患者和對(duì)照組（P＜0.05）。對(duì)照組和Ⅰ級(jí)高血壓患者內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)Ang-1、Tie2 mRNA表達(dá)以及Tie2磷酸化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

表1 各組內(nèi)皮祖細(xì)胞Ang-1、Tie2 mRNA表達(dá)和Tie2酪氨酸磷酸化水平比較（x±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與高血壓Ⅰ級(jí)比較，△P＜0.05；與高血壓Ⅱ級(jí)比較，▲P＜0.05

2.2 治療前后內(nèi)皮祖細(xì)胞Ang-1和Tie2水平表達(dá)變化

Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)高血壓患者經(jīng)治療后內(nèi)皮祖細(xì)胞Ang-1和Tie2 mRNA表達(dá)均高于治療前水平（P＜0.05）。治療后內(nèi)皮祖細(xì)胞Tie2酪氨酸磷酸化水平上調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 治療前后內(nèi)皮祖細(xì)胞Ang-1、Tie2表達(dá)和Tie2酪氨酸磷酸化水平比較（x±s）

3 討論

原發(fā)性高血壓形成的高血流應(yīng)切力可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。血壓越高，損傷越大，越難以修復(fù)，進(jìn)而發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等嚴(yán)重合并癥[5-7]。內(nèi)皮祖細(xì)胞是具有增殖分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的一類前體細(xì)胞，與新生血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)有關(guān)[8]。然而越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)[9-11]，高血壓患者循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量減低、功能障礙，內(nèi)皮細(xì)胞得不到修復(fù)與更新，病情無(wú)法逆轉(zhuǎn)。如何解釋這一現(xiàn)象對(duì)于疾病的控制至關(guān)重要。

Tie2是一類酶聯(lián)受體，廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞上，Ang-1、Ang-2是其主要配體，Ang-1能保持血管內(nèi)皮的穩(wěn)定性，促使血管成熟；Ang-2是Ang-1內(nèi)源性拮抗劑，破壞血管的穩(wěn)態(tài)。Ang-1與Tie2受體結(jié)合后酪氨酸殘基被磷酸化進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞的生物學(xué)功能[12-14]。內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程，很可能依賴Ang-1/Tie2信號(hào)通路精密調(diào)控，通路表達(dá)失衡可直接影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員和遷移，加速血管內(nèi)皮的損傷及炎癥過(guò)程[15-16]。內(nèi)皮祖細(xì)胞上Ang-1/Tie2通路表達(dá)與高血壓之間的關(guān)系目前國(guó)內(nèi)鮮有研究。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著患者高血壓分級(jí)的增高，內(nèi)皮祖細(xì)胞Ang-1和Tie2 mRNA水平逐級(jí)降低，且具有生物活性的磷酸化Tie2水平也平行下調(diào)，表明信號(hào)通路的活性降低，血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)能力減弱，從而解釋了內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量下降及功能喪失的原因。同時(shí)也觀察到，經(jīng)過(guò)降壓治療后，Ang-1和Tie2的表達(dá)明顯改善，說(shuō)明高血壓的因素去除之后，內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)活動(dòng)增強(qiáng)，再次證實(shí)了內(nèi)皮祖細(xì)胞依賴Ang-1/Tie2系統(tǒng)調(diào)控的推斷。

此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，高血壓Ⅰ級(jí)患者的Ang-1和Tie2水平較之對(duì)照組并無(wú)明顯差異，推測(cè)此階段的內(nèi)皮祖細(xì)胞仍具有較強(qiáng)的代償能力，機(jī)體處于平衡狀態(tài)，血壓控制之后，發(fā)生心血管意外的概率明顯低于其他兩組。因此，內(nèi)皮祖細(xì)胞Ang-1和Tie2表達(dá)也可作為預(yù)測(cè)血管功能和心血管危險(xiǎn)度的指標(biāo)之一[17-20]。

綜上所述，內(nèi)皮祖細(xì)胞Ang-1/Tie2的表達(dá)可能與高血壓病血管損傷有密切關(guān)系，可通過(guò)Ang-1/Tie2表達(dá)的水平對(duì)患者的血管損傷程度和治療效果進(jìn)行判斷，進(jìn)而在臨床上發(fā)揮重要作用。

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