朱榮華，劉峰，崔莉，趙恒強(qiáng)，王曉，張樹芹

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014）

*中藥與天然活性產(chǎn)物*

乳狀液膜分離丹參水提液中的丹酚酸B

朱榮華1，2，劉峰2，崔莉2，趙恒強(qiáng)2，王曉2，張樹芹1*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014）

建立了一種通過油包水（W／O）乳狀液膜體系分離丹參水提液中丹酚酸B的方法。通過對內(nèi)水相氫氧化鈉濃度、表面活性劑山梨糖醇酐油酸酯（Span80）用量、載體三辛胺濃度、油內(nèi)比、乳水比和遷移時間的優(yōu)化，獲得了一個高效的乳狀液膜體系。最優(yōu)提取條件為氫氧化鈉濃度0.012 5 mol／L，山梨糖醇酐油酸酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%，三辛胺濃度0.01 mol／L，油內(nèi)比10：6，乳水比1：4，遷移時間10 min。實驗結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，該乳狀液膜體系能快速有效地從實際樣品中提取分離丹酚酸B。

乳狀液膜；丹酚酸B；提取率

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhizaBunge）的根及根莖，屬于中國傳統(tǒng)中藥，廣泛用于心血管疾病的預(yù)防和治療［1－2］。丹酚酸B是丹參中的主要水溶性成分，具有預(yù)防老年癡呆［3］、降血壓［4］、抗動脈粥樣硬化［5］、保護(hù)皮膚光澤和防老化［6］等活性。

乳狀液膜是利用表面活性劑的乳化現(xiàn)象，在互不相溶的兩液相之間，經(jīng)選擇性滲透，將化合物分離的一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的分離手段。目前，液膜分離技術(shù)主要應(yīng)用在廢水處理［7］和冶金行業(yè)［8］中，但是近年來利用乳狀液膜技術(shù)分離天然產(chǎn)物活性物質(zhì)也逐漸成為研究熱點［9－10］。傳統(tǒng)的丹酚酸B制備主要是乙醇或水提取后，再以大孔樹脂［11］、分子篩分離純化、醋酸乙酯與碳酸鈉溶液交替萃取［12－13］等方法純化，工藝復(fù)雜，有機(jī)溶劑消耗量較大。

本實驗以三辛胺為載體，山梨糖醇酐油酸酯（Span80）為表面活性劑，煤油為油相，氫氧化鈉為內(nèi)水相，機(jī)械攪拌法制成乳狀液，丹酚酸B對照品溶液為外水相進(jìn)行液膜萃取單因素實驗。以微波－離心法破乳，優(yōu)化實驗條件。最后用丹參水提液進(jìn)行分離實驗，利用高效液相色譜驗證萃取效果，為丹酚酸B乳狀液膜萃取提供實驗依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent1120高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；FA25實驗室高剪切分散乳化機(jī)（上海弗魯克公司）；84-1型磁力攪拌器（上海鄄城光明儀器有限公司）；BSA124S電子天平（Sartorius公司）。

1.2 原料與試劑

丹參購自山東中醫(yī)藥大學(xué)中魯藥店；丹酚酸B對照品，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，購自天然產(chǎn)物國家標(biāo)準(zhǔn)樣品參比實驗室；乙腈為色譜純，Span80、煤油、三辛胺，均購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇為分析純，購自濟(jì)南巨業(yè)化學(xué)試劑有限公司。

圖1 丹酚酸B的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of salvianolic acid B

2 實驗方法

2.1 樣品制備

2.1.1 丹酚酸B對照品

準(zhǔn)確稱取0.18 g丹酚酸B對照品，用去離子水稀釋定容至1 L，配得濃度為0.18 g／L的丹酚酸B樣品，備用。

2.1.2 丹參樣品

稱取20 g丹參加入200 mL去離子水，回流加熱1 h，抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至密度約為1.1 g／mL，邊攪拌邊加入等體積的乙醇，靜置分層，過濾。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得丹參浸膏，將浸膏凍干即可得丹參粗提物。稱取0.20 g丹參粗提物溶于500.0 mL去離子水，得0.4 g／L丹參試樣，備用。

2.2 乳狀液膜的制備

分別將表面活性劑Span80和三辛胺溶于煤油，置于FA25高剪切分散乳化機(jī)，在高速（10 000 r／min）攪拌下緩慢加入氫氧化鈉溶液，攪拌2 min，即可制得穩(wěn)定的W／O型乳狀液膜，備用。

2.3 液膜萃取

量取一定量的試液，按一定的乳水比（1：10、1：8、1：6、1：4、1：2、1：1（V／V）緩慢加入上述所制乳狀液膜，以250 r／min低速攪拌一定時間（2、5、7、10、12、15、20 min），倒入分液漏斗靜置分層，上層是乳狀液膜相，下層是水相。

2.4 破乳

將有機(jī)相用微波法進(jìn)行破乳后，以2 000 r／min離心10 min，乳狀液和內(nèi)水相兩相分離，上層是乳狀液，下層是富集在內(nèi)水相的丹酚酸B水溶液。將下層富集的丹酚酸B水溶液用0.45μm有機(jī)膜濾過后，HPLC分析丹酚酸B含量。

2.5 液相色譜條件

Agilent1120高效液相色譜儀，色譜柱：Welch Materials C18（250×4.6mm，5μm，Welch Materials，Inc.，美國）；流動相：A為乙腈，B為體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸水溶液，30%A等度洗脫30 min；流速：1 m L／min；進(jìn)樣量：5μL；柱溫：25℃；檢測波長：286 nm。

2.6 丹酚酸B含量測定

將0.18 g／L的丹酚酸B對照品溶液，用去離子水分別稀釋2、5、10、20、50倍后，用高效液相于286 nm下分別測定其峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，丹酚酸B濃度（g／L）為橫坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程：Y＝0.023＋21.83642X，R2＝0.9998。

分別取丹酚酸B樣品、丹酚酸B提取液、丹參試樣、丹參提取液溶液，測定丹酚酸B含量，計算提取率，取3次實驗平均值。

3 結(jié)果與討論

3.1 對照品萃取實驗

3.1.1 內(nèi)水相氫氧化鈉濃度對提取率的影響

準(zhǔn)確配制內(nèi)水相氫氧化鈉溶液濃度分別為0、0.005、0.012 5、0.03、0.06、0.1 mol／L，三辛胺濃度為0.01 mol／L，Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%，油內(nèi)比（V／V）為10：6的乳狀液膜。按乳水比（V／V）1：6移取丹酚酸B對照品溶液與上述乳狀液混合，進(jìn)行乳狀液膜提取。

外水相丹酚酸B與膜相中的載體結(jié)合，進(jìn)入膜相，在膜相－內(nèi)水相界面上與內(nèi)水相中的氫氧化鈉反應(yīng)，釋放出的丹酚酸B陰離子進(jìn)入內(nèi)水相，同時載體陽離子結(jié)合OH－形成中性載體分子回到膜相。內(nèi)、外相的OH－濃度差為遷移提供動力。從圖2中可知，當(dāng)氫氧化鈉溶液的濃度從0增大到0.1 mol／L時，丹酚酸B的提取率先增大后減小，在濃度為0.012 5 mol／L時，提取率最高。這是因為當(dāng)內(nèi)水相氫氧化鈉濃度較小時，丹酚酸B遷移的主要決定因素是內(nèi)水相中OH－的濃度，內(nèi)水相OH－濃度越高，越有利于丹酚酸B向內(nèi)水相遷移。但氫氧化鈉濃度過高時，過強(qiáng)的堿效應(yīng)會破壞液膜的穩(wěn)定性，使膜破裂率增大，提取率反而下降。因此，實驗中氫氧化鈉濃度應(yīng)選擇0.012 5 mol／L。

圖2 氫氧化鈉的濃度對丹酚酸B提取率的影響Fig.2 Impact of NaOH concentration on the extraction rate of salvianolic acid B

3.1.2 載體三辛胺的濃度對提取率的影響

準(zhǔn)確配制三辛胺濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mol／L，內(nèi)水相氫氧化鈉溶液濃度為0.012 5 mol／L，Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%，油內(nèi)比（V／V）為10：6的乳狀液膜。按乳水比（V／V）1：6移取丹酚酸B樣品與上述乳狀液膜混合，進(jìn)行提取。

圖3 三辛胺的濃度對丹酚酸B提取率的影響Fig.3 Impact of trioctylamine concentration on the extraction rate of salvianolic acid B

載體在萃取過程中起到傳輸?shù)し铀酈的作用，外水相中的丹酚酸B陰離子與載體反應(yīng)生成中性配合物，進(jìn)入膜相，再被反萃到內(nèi)水相。由圖3可知，當(dāng)三辛胺濃度在0.0～0.01 mol／L范圍時，隨著三辛胺濃度增大，丹酚酸B的提取通量增大，乳狀液膜對丹酚酸B的提取率不斷增大；三辛胺濃度進(jìn)一步增大時，由于有機(jī)膜相的黏度變大，傳質(zhì)阻力增大，丹酚酸B的提取率開始下降。所以，實驗中三辛胺的濃度以0.01 mol／L較為適宜。

3.1.3 表面活性劑Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對提取率的影響

準(zhǔn)確配制Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，內(nèi)水相NaOH溶液濃度為0.012 5 mol／L，三辛胺濃度為0.01 mol／L，油內(nèi)比（V／V）為10：6的乳狀液膜。按乳水比（V／V）1：6移取丹酚酸B樣品與上述乳狀液膜混合，進(jìn)行提取。

乳狀液膜相中的表面活性劑濃度對乳狀液膜分離過程中傳質(zhì)、溶脹、分散和破裂等過程都有直接的影響［14］。由圖4可知，當(dāng)Span80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由1.0%增加到4.0%時，丹酚酸B的提取率明顯增大；當(dāng)Span80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于4.0%之后，丹酚酸B的提取率出現(xiàn)明顯下降趨勢。原因是當(dāng)Span80的含量較小時，液膜的穩(wěn)定性低，隨著攪拌時間的延長，液膜易發(fā)生破裂使丹酚酸B的遷移受到影響；當(dāng)Span80的含量較大時，增大了液膜的黏度，使丹酚酸B與載體形成的配合物在液膜中傳輸阻力增大，不利于它的傳輸。因此，實驗中Span80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)選擇4.0%。

圖4 Span80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對丹酚酸B提取率的影響Fig.4 Impact of Span80 mass fraction on the extraction rate of salvianolic acid B

3.1.4 油內(nèi)比對提取率的影響

準(zhǔn)確配制內(nèi)水相氫氧化鈉溶液濃度為0.012 5 mol／L，三辛胺濃度為0.01 mol／L，Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%，油內(nèi)比（V／V）分別為10：10、10：8、10：6、10：5、10：3、10：1的乳狀液膜。按乳水比（V／V）1：6移取丹酚酸B樣品與上述乳狀液膜混合，進(jìn)行提取。

油內(nèi)比是影響液膜穩(wěn)定性的重要因素。由圖5可以看出，當(dāng)油內(nèi)比從10：10增大到10：5時，丹酚酸B的提取率一直呈增大趨勢。原因是隨著油內(nèi)比的增大，液膜的穩(wěn)定性增強(qiáng)，有利于丹酚酸B的遷移。但是當(dāng)油內(nèi)比高于10：5時，油內(nèi)比越大液膜厚度就越大，越不利于丹酚酸B的遷移，因此提取率開始下降，同時當(dāng)油內(nèi)比高于10：8時，乳狀液膜與丹酚酸B攪拌后的混合溶液出現(xiàn)粘稠現(xiàn)象，靜置分層所需時間逐漸延長。綜合考慮經(jīng)濟(jì)、高效等因素，本實驗的最佳油內(nèi)比為10：6。

圖5 油內(nèi)比對丹酚酸B提取率的影響Fig.5 Impact of Roi on the extraction rate of salvianolic acid B

3.1.5 乳水比對提取率的影響

準(zhǔn)確配制內(nèi)水相氫氧化鈉溶液濃度為0.012 5 mol／L，三辛胺濃度為0.01 mol／L，Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%，油內(nèi)比（V／V）為10：6的乳狀液膜。分別按乳水比（V／V）為1：10、1：8、1：6、1：4、1：2、1：1移取丹酚酸B樣品與上述乳狀液膜混合，進(jìn)行提取。

乳水比是影響丹酚酸B提取的主要工藝參數(shù)，體現(xiàn)了液膜分離的能力。由圖6可以看出，當(dāng)乳水比從1：10增大到1：4時，丹酚酸B的提取率一直呈增大趨勢；當(dāng)乳水比高于1：4，丹酚酸B的提取率基本達(dá)到平衡。這是因為增大乳水比能增大傳質(zhì)表面積，縮短操作時間，但載體的用量也會相應(yīng)增加，從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮，1：4為最佳乳水比。

圖6 乳水比對丹酚酸B提取率的影響Fig.6 Impact of Rew concentration on the extraction rate of salvianolic acid B

3.1.6 提取時間對提取率的影響

準(zhǔn)確配制內(nèi)水相氫氧化鈉溶液濃度為0.012 5mol／L，三辛胺濃度為0.01 mol／L，Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%，油內(nèi)比（V／V）為10：6的乳狀液膜。按乳水比（V／V）為1：4移取丹酚酸B樣品與上述乳狀液膜混合，進(jìn)行提取，提取時間分別為2、5、7、10、12、15、20 min。

乳狀液膜是一種亞穩(wěn)態(tài)體系，不可能長時間的穩(wěn)定存在。因此無論從液膜的穩(wěn)定性，還是從工作效率來考慮，遷移時間都是液膜分離提取技術(shù)中的一個重要參數(shù)［10］。由圖7可以看出，提取時間在2～10 min范圍內(nèi)，隨著提取時間的延長，提取率明顯上升；當(dāng)提取時間在10～12 min范圍內(nèi)時，得到一個高效率的乳狀液膜體系，提取率可以達(dá)到98%以上。但同時也發(fā)現(xiàn)液膜存在穩(wěn)定時間短的缺陷，當(dāng)提取時間大于12 min時，隨著提取時間的延長，提取率出現(xiàn)明顯下降趨勢。這可能是因為丹酚酸B料液中含有大量的無機(jī)鹽等電解質(zhì)，這些共存物會影響液膜的穩(wěn)定性。所以本實驗的最佳遷移時間是10 min。

圖7 攪拌時間對丹酚酸B提取率的影響Fig.7 Impact of transport time on the extraction rate of salvianolic acid B

3.2 丹參粗提取液中丹酚酸B的液膜萃取最佳工藝研究

按照最佳提取工藝（表1），準(zhǔn)確配制內(nèi)水相氫氧化鈉溶液濃度為0.012 5 mol／L，三辛胺濃度為0.01 mol／L，Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%，油內(nèi)比（V／V）為10：6的乳狀液膜。按乳水比（V／V）為1：4移取丹參樣與該乳狀液膜混合，提取10 min，測定丹酚酸B的含量。取三組平行實驗的平均值，丹酚酸B的萃取回收率可達(dá)到（90.6±1.21）%。將丹參樣和經(jīng)過液膜萃取破乳后內(nèi)水相的樣品用Agilent1120高效液相色譜進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果如圖8所示。丹參水提物中的丹酚酸B經(jīng)過液膜萃取后，濃度明顯升高，即得到了明顯的富集，可有效地進(jìn)行丹酚酸B萃取。

圖8 不同樣品的液相色譜圖Fig.8 HPLC chromatograms of different salvianolic acid B standard solution

表1 最佳提取工藝條件Table 1 Optimal extraction process condition

4 結(jié)論

本實驗通過對內(nèi)水相氫氧化鈉濃度、表面活性劑Span80用量、載體三辛胺濃度、油內(nèi)比、乳水比和遷移時間的優(yōu)化，獲得了一個萃取丹參水提液中丹酚酸B的高效乳狀液膜體系。乳狀液膜分離方法與傳統(tǒng)分離方法相比，有機(jī)溶劑用量少且可重復(fù)使用，具有簡單、快速、高效，選擇性好、經(jīng)濟(jì)節(jié)能以及環(huán)境友好等優(yōu)點，是一種最新的科學(xué)可行的分離富集方法。

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Separation and extraction of salvianolic acid B from Salvia miltiorrhiza by emulsion liquid membrane

ZHU Rong-hua1，2，LIU Feng2，CUILi2，ZHAO Heng-q iang2，WANG Xiao2，ZHANG Shu-qin1*
（1.School of Chemistry and Material Science，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China；2.Shandong Analysis and Test Center，Jinan 250014，China）

This paper constructed a method for separation and extraction of salvianolic acid B fromSalvia miltiorrhizawith W／O emulsion liquid membrane. We obtained an efficient emulsion liquid membrane system by the optimization of internal aqueous NaOH concentration，the content of surfactant Span80，carrier trioctylamine concentration，the ratio of oil phase to internal aqueous solution，the ratio of emulsion phase to external aqueous solution and transport time. The optimal extraction conditions are transport time of 10 minutes，Span80 mass fraction of 4.0%，trioctylamine concentration of 0.01 moL／L，the ratio of oil phase to internal aqueous solution of 10：6，the ratio of emulsion phase to external aqueous solution of 1：4 and NaOH concentration of 0.012 5 mol／L.Experimental results show that the emulsion liquid membrane system can rapidly and efficiently extract salvianolic acid B from actual samples in the optimal conditions.

emulsion liquid membrane；salvianolic acid B；extraction rate

R284.2；TQ028.8

A

1002-4026（2014）01-0034-06

10.3976／j.issn.1002－4026.2014.01.006

2013-11-16

山東省大型科學(xué)儀器設(shè)備升級改造技術(shù)專項（2012SJGZ01）

朱榮華（1987－），女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物。

*通訊作者，張樹芹，女，博士，研究方向為膠體化學(xué)。Email：zsqtaian＠sdau．edu．cn