張坤，梁秀麗

（中國兵器工業(yè)集團第五三研究所，濟南 250031）

動態(tài)超聲輔助萃取與HPLC聯(lián)用測定淫羊藿中黃酮類化合物

張坤，梁秀麗

（中國兵器工業(yè)集團第五三研究所，濟南 250031）

建立了動態(tài)超聲輔助萃取與高效液相色譜在線聯(lián)用系統(tǒng)，用于測量淫羊藿中黃酮類化合物。萃取過程在一個循環(huán)體系中完成，萃取完成后，通過采樣環(huán)采集20 μL萃取液，萃取液被流動相載入色譜系統(tǒng)進行分離檢測。4種黃酮類化合物用HPLC-MS區(qū)分，通過比較色譜峰面積選擇優(yōu)化萃取條件。選擇50℃的水浴溫度，50%的乙醇作為萃取劑，萃取劑流速為1.5 mL/min，萃取時間為8 min，樣品量為15 mg。用該法測量淫羊藿樣品中4種黃酮類化合物，日內、日間精密度分別為1.05%～2.05%，0.30%～3.63%（n=6）。淫羊藿中的主要化合物淫羊藿苷的加標回收率為95.2%。該方法可用于測量淫羊藿中的黃酮類化合物。

在線動態(tài)超聲輔助萃??；高效液相色譜；淫羊藿；黃酮

淫羊藿（ Epimedium Kor eamum Nakai）別名仙靈脾，為小檗科淫羊藿屬（family berberidaceae）植物［1］，是中國傳統(tǒng)的益補中藥，性溫，味甘辛，歸肝、腎經(jīng)，臨床上常用于陽痿遺精，筋骨酸軟，風濕痹痛，麻木拘攣以及慢性氣管炎、神經(jīng)衰弱和心腦血管疾病等癥［2-3］?，F(xiàn)代研究表明其有效成分主要為淫羊藿苷、總黃酮及多糖。文獻報道淫羊藿總黃酮、淫羊藿苷的萃取工藝有回流法［4-7］、索氏提取法［8］，這兩種方法所需樣品及萃取溶劑量較大，且需要較長的萃取時間。目前，一些新的方法被引用到淫羊藿的萃取中。Liu［9］等用高壓密閉微波法、常壓微波法、超聲法、回流法萃取淫羊藿中黃酮類化合物，其中高壓密閉法得到的萃取率最高，但是有些化合物在高溫、高壓條件下易降解。姜寧［10］等采用加速溶劑萃取系統(tǒng)進行淫羊藿中淫羊藿苷的快速萃取及測定，萃取時間為20 min，萃取率為93.15%。

動態(tài)萃取是最近才提出的一種嶄新的方法，這種技術是基于流動的萃取溶液連續(xù)地通過固體基質將目標物質萃取出來，動態(tài)萃取最早應用于沉積物和土壤樣品中重金屬的萃取。近年來，動態(tài)萃取技術正逐步引起人們的重視。陳立鋼［11］等采用動態(tài)微波輔助萃取的方法萃取淫羊藿中的黃酮類化合物，其產(chǎn)率高于索氏萃取和回流萃取。

筆者采用動態(tài)超聲輔助萃取與高效液相色譜聯(lián)用的方法測定淫羊藿中4種黃酮類化合物，具有分析時間短、樣品用量小等優(yōu)點，而且在線過濾及在線測量系統(tǒng)的設計減少了萃取劑的用量，降低了萃取劑對環(huán)境的危害，也降低了實驗人員與萃取劑接觸的可能性。該方法可用于測定淫羊藿中的淫羊藿苷及朝藿苷A，B，C的含量。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Ailgent 1100型，美國Agilent公司；

萃取池：玻璃制品，為自行設計加工，長度為60.0 mm，內徑為3.0 mm；

超聲波清洗器：KQ-800KDE型，功率為100 W，昆山超聲儀器有限公司；

蠕動泵：FI-2100型，北京海光儀器公司；

紫外分光光度計：GBC Cintra 10e型，澳大利亞GBC科學儀器公司；

質譜儀：ABI Q-Trap型，電噴霧離子源，Analyst 1.4 數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)，美國應用生物系統(tǒng)公司；

淫羊藿苷標準品：中國藥品生物制品檢驗所；

淫羊藿苷標準儲備液：準確稱取淫羊藿苷標準品4.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得到0.4 mg/mL的標準儲備液，然后用甲醇稀釋至不同濃度，保存于冰箱中；

淫羊藿樣品：市售，用粉碎機粉碎，過0.38 mm（40目）篩后備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 動態(tài)超聲輔助萃取（DUAE）

自行組裝動態(tài)超聲輔助萃取裝置。準確稱取一定量的淫羊藿樣品置于玻璃制成的萃取池中，樣品兩端用玻璃棉堵住，然后用塞子密封，將萃取池固定在超聲清洗器中，量取5 mL乙醇溶液于儲存瓶中，開啟蠕動泵，儲存瓶中的萃取液被蠕動泵泵出，流經(jīng)萃取池，打開超聲清洗器，萃取劑在管路中循環(huán)流動。與此同時，開啟液相色譜的高壓泵，建立色譜基線。萃取經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，轉換六通閥，萃取劑通過在線過濾被蠕動泵泵到液相色譜20 μL的取樣環(huán)中，之后轉換進樣閥，取樣環(huán)中的萃取液被流動相載入色譜柱進行分離。

1.2.2 靜態(tài)超聲輔助萃取（UAE）

準確稱取0.5 g淫羊藿樣品于錐形瓶中，加入50 mL 50%乙醇溶液，標記刻度，將錐形瓶放在超聲清洗器中超聲萃取1 h，然后向錐形瓶中加50%乙醇溶液至標線，過濾萃取液，取3 mL溶液，用50%乙醇定容于10 mL容量瓶中，過0.45 μm濾膜，進樣量20 μL，用HPLC分析。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

1.3.2 質譜條件

氣簾氣和霧化氣：均為N2，壓力為0.21 MPa（30 psi）；噴霧電壓：5 000 V；解簇電壓：120 V；入口電壓：10 V；碰撞能量：10 eV。

1.4 總黃酮量的測定

用紫外可見分光光度計測定淫羊藿中總黃酮的含量，檢測波長為270 nm，以不同濃度的淫羊藿甘標準品溶液對應的紫外吸收峰峰面積作標準曲線，線性范圍為1.24～9.92 μg/mL，線性回歸方程為Y=0.055 66X-0.013 7，相關系數(shù)r=0.999 3。每次實驗測定均取1 mL 萃取液，用萃取溶劑稀釋至10 mL，得到適當?shù)淖贤馕舛取?/p>

2 結果與討論

2.1 HPLC/MS分離鑒別4種黃酮類化合物

淫羊藿萃取物的色譜圖如圖1所示，對應的質譜數(shù)據(jù)列于表1。根據(jù)得到的質譜數(shù)據(jù)和相關文獻報道［9，11］可判定，液相色譜圖上的4個色譜峰對應的化合物分別是朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷。

圖1 淫羊藿萃取物的色譜圖

2.2 萃取條件的優(yōu)化

基于現(xiàn)場實際條件，山路崎嶇不平，路段狹窄，不適合板狀天線的推進，因此選擇適應山坡路段的蛇形軟質天線，即超強地面耦合天線(RTA50 MHz)執(zhí)行本次勘探任務。雷達測線按垂直于坡體等高線方向單向布置，測線方向由坡腳向坡頂行進，測線覆蓋整個滑坡區(qū)域，在測線的起始處沿測線方向均向外延伸5～10 m，以便進行比對分析。在滑坡后壁處，測線向后壁上方繼續(xù)行進5～10 m，以便對滑坡整體機制做出合理推測和解釋。本文在所有探測結果中，主要選擇一條有代表性的探測剖面進行分析解譯。測線布置圖如上圖2所示。

2.2.1 萃取劑的選擇

將乙醇配成不同濃度的溶液作為萃取劑，體積分數(shù)范圍為30%～70%，梯度為10%。稱取10 mg淫羊藿樣品，設定超聲清洗器水浴溫度為30℃，萃取劑流量為1.0 mL/min，萃取時間為10 min。在低濃度時，乙醇濃度與4種黃酮類化合物的萃取率成正比；乙醇濃度越高，萃取率越大；當乙醇濃度達到50%時，萃取率最大，隨后萃取率下降。實驗選擇50%的乙醇作為萃取劑。

表1 淫羊藿萃取物中4種黃酮類化合物的質譜碎片

2.2.2 超聲萃取水浴溫度的影響

稱取10 mg淫羊藿樣品，改變水浴溫度，溫度范圍為20～80℃，溫度梯度為10℃，以50%的乙醇作為萃取劑，萃取劑流量為1.0 mL/min ，萃取時間為10 min。水浴溫度對4種黃酮類化合物的萃取率影響不大，當水浴溫度高于60℃時，朝藿苷C 的萃取率略有下降。實驗選擇50℃的水浴溫度。

2.2.3 萃取劑流量的選擇

稱取10 mg淫羊藿樣品，以50%的乙醇作為萃取劑，在超聲萃取的水浴溫度為50℃，萃取時間為10 min的條件下進行萃取，考察萃取劑流速對4種黃酮類化合物色譜峰面積的影響，流量范圍為1.0～3.0 mL/min，梯度為0.5 mL/min，萃取劑流速對4種黃酮類化合物的產(chǎn)率影響不大。實驗選擇萃取劑流量為1.5 mL/min。

2.2.4 萃取時間的選擇

稱取10 mg淫羊藿樣品，以50%乙醇作萃取劑，超聲水浴溫度為50℃，萃取劑流量為1.5 mL/min。改變萃取時間，考察萃取時間對萃取率的影響，萃取時間由1～12 min，每隔1 min試驗一次。結果表明待測物的萃取率隨著超聲萃取時間的增大而增大，當萃取時間達6 min時，萃取率不再發(fā)生明顯變化。實驗選擇樣品萃取時間為8 min，以保證待測物的完全萃取。

2.2.5 樣品量的影響

改變樣品量，以50%的乙醇作為萃取劑，超聲水浴溫度為50℃，萃取劑流量為1.5 mL/min，萃取時間8 min，測得4種黃酮類化合物的峰面積列于表2。由表2可知，在動態(tài)超聲輔助萃取中，樣品量的大小對待測物萃取率的影響較小。實驗選擇樣品量為15 mg。

表2 不同樣品量4種黃酮類化合物的色譜峰面積

2.3 標準工作曲線

取不同濃度的淫羊藿苷標準品溶液，依次進樣，在選定的HPLC條件下，以溶液的質量濃度c（mg/mL）為橫坐標、峰面積A為縱坐標作線性回歸，標準品溶液質量濃度在1.6～20 μg/mL范圍內線性關系良好，線性回歸方程為A=31.3c-15.19，相關系數(shù)r=0.999 1。

測定淫羊藿中總黃酮的含量，以不同濃度的淫羊藿苷標準品溶液對應的紫外吸收峰峰面積作標準曲線，線性范圍為1.24～9.92 μg/mL，線性回歸方程為A=0.055 66c-0.013 68，相關系數(shù)r=0.999 3。表明在線性范圍內線性關系良好。

2.4 精密度和準確度

在1 d內連續(xù)分析6個淫羊藿樣品，朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷色譜峰面積測定數(shù)據(jù)見表3。由表3可知，朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷色譜峰面積的日內精密度分別為1.05%，1.75%，2.05%，1.85%。每天分析一個樣品，連續(xù)分析6 d，朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷色譜峰面積測定數(shù)據(jù)見表4。由表4可知，朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷日間精密度分別為0.97%，0.30%，2.78%，3.63%。

表3 日內精密度試驗結果

表4 日間精密度試驗結果

精密稱取淫羊藿樣品15 mg 3份，分別加入1.0mL質量濃度為20 μg/mL淫羊藿苷標準品儲備液，室溫下放置24 h后，按1.2實驗方法萃取樣品，淫羊藿苷回收試驗結果列于表5。由表5可知，淫羊藿苷加標回收率為95.2%。

表5 淫羊藿苷加標回收試驗結果

2.5 比對試驗

取不同產(chǎn)地的淫羊藿樣品（樣品1、樣品2、樣品3的產(chǎn)地分別為吉林、安徽、河北），分別用動態(tài)超聲輔助萃?。―UAE）法和藥典方法（UAE）比較，結果見表6。由表6可知，動態(tài)超聲輔助萃取法和藥典方法萃取率相當，但動態(tài)超聲輔助萃取法耗時短，樣品和萃取劑用量少，操作簡單。

表6 比對試驗色譜峰面積 pA·s

2.6 淫羊藿苷和總黃酮的含量

對淫羊藿質量的評價大多以淫羊藿苷或總黃酮含量為指標，分別用動態(tài)超聲輔助萃取法和藥典方法對不同產(chǎn)地的淫羊藿樣品進行萃取處理，然后測定樣品中淫羊藿苷和總黃酮的含量，測定結果見表7。

由表7數(shù)據(jù)可知，不同產(chǎn)地的淫羊藿中淫羊藿苷的含量明顯不同，總黃酮含量則相差不多。

表7 不同產(chǎn)地淫羊藿中淫羊藿苷和總黃酮的含量 mg/g

3 結語

用動態(tài)超聲輔助萃取法萃取淫羊藿中朝霍苷A、朝霍苷B、朝霍苷C和淫羊藿苷，與藥典中規(guī)定的方法得到了相似的萃取率，而本方法使用的萃取劑用量少，耗時短。該法與高效液相色譜在線聯(lián)用，實現(xiàn)了對淫羊藿的在線萃取、分離和檢測，減少了樣品損失，簡化了整個分析過程。

［1］葉麗卡，陳濟民.淫羊藿的藥理進展［J］.中國中藥雜志，2001，26(5): 293-294.

［2］藺學燕，董傳海，李偉華，等.淫羊藿有效成分的藥理研究與臨床應用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2005，16(9): 917-918.

［3］孟坤，劉冠中.天然藥物淫羊藿和巴戟天的免疫調節(jié)作用研究進展［J］.中國醫(yī)藥學報，2003，18(8): 493-495.

［4］馬維坤，陳文，段國峰.淫羊藿總黃酮萃取分離工藝研究［J］.中醫(yī)藥學刊，2006，24(3): 157-158.

［5］張峻穎，黃羅生，陳健，等.淫羊藿醇提工藝研究［J］.海峽藥學，2004，16(1): 61-63.

［6］杜永峰，陳金云，姚秉華.高效液相色譜法測定箭葉淫羊藿中淫羊藿苷的含量［J］.化學分析計量，2006，15(6): 62-63.

［7］黎萬壽，陳幸.淫羊藿苷萃取工藝研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2000，11(11): 971-972.

［8］彭海燕，段林侃，劉敏，等.淫羊藿苷萃取工藝優(yōu)化［J］.化學與生物工程，2006，23(9): 27-28.

［9］Liu Z Y，Ding L，Zhang H Q，et al. Comparison of the different extraction methods of flavonoids in Epimedium Koreamum Nakai by HPLC-DAD-ESI-MSn［J］. J Liq Chromatogr R T，2006，29(5): 719-731.

［10］姜寧，劉曉鵬.淫羊藿中淫羊藿苷的快速萃取及測定研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2008，23(1): 64-66.

［11］Chen L G，Jin H Y，Ding L，et al. Dynamic microwaveassisted extraction of flavonoids from Herba Epimedii［J］. Sep Purification Tec，2008，59: 50-57.

內蒙廢止18項食品安全地方標準

4月10日，內蒙古自治區(qū)衛(wèi)生計生委發(fā)布2014年第6號公告稱，決定對18個食品安全地方標準予以廢止，2個食品地方標準保留并進行修訂。

18個廢止的食品安全地方標準名稱是：鮮綠蘆筍，牛奶蒸餾酒，沙棘籽油中亞油酸與亞麻酸的測定（氣相色譜法），內蒙古優(yōu)質無公害大米，發(fā)酵性奶酒，食用沙棘籽油，食用沙棘果汁油，蒸制類面食品，非發(fā)酵豆制品，蕎麥米(仁)檢驗規(guī)程，混糖月餅，乳及乳制品中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素殘留量的測定（高效液相色譜法），乳及乳制品中黃曲霉毒素M1含量的測定（高效液相色譜法），脫水胡蘿卜片(粒)檢驗規(guī)程，鹽漬寶塔菜檢驗規(guī)程，糜、黃(大黃米)米，線麻籽油、蓖麻籽油，奶片。2個保留修訂的食品地方標準名稱是炒米、風干牛肉。

（儀器信息網(wǎng)）

Determination of Flavonoids in Epimedium Koreamum Nakai by Dynamic Ultrasonic-assisted Extraction System Coupled with HPLC

Zhang Kun， Liang Xiuli
(CNGC Institue 53， Jinan 250031， China)

The dynamic ultrasonic-assisted extraction (DUAE) system coupled with HPLC was used for determination of four flavonoids in epimedium koreamum nakai. The extraction was performed in a recirculating system. When the extraction was completed, the extract (20 μL) was driven to the analytical column by mobile phase and measured by a UV detector. The four flavonoids were identified by HPLC-MS. The extraction parameters of the procedure were optimized by comparison with the peak areas of HPLC. The extraction temperature was 50℃in water bath, the extract solvent was 50% ethanol, the extractant flow rate was 1.5 mL/min, the extraction time was 8 min, and the quantity of the sample was 15 mg. Four flavonoids were measured by the method, the RSD of intra-day and inter-day were 1.05%-2.05% and 0.30%-3.63% (n=6), respectively. The method was applied to determine icariin which was major component in the herb, and the added recovery was 95.2%. The method was successfully applied to the determination of flavonoids in epimedium koreamum nakai.

on-line dynamic ultrasonic-assisted extraction; HPLC; epimedium koreamum naka; flavonoids

O657.7

A

1008-6145(2014)03-0053-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2014.03.015

聯(lián)系人：張坤；E-mail: zhangkun8185@163.com

2014-04-10