陳偉珠，謝全靈，張怡評，洪專，方華，洪碧紅，易瑞灶

（1.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005； 2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系，化學(xué)生物學(xué)福建省重點實驗室，福建廈門 361005）

4，9-脫水河豚毒素國家標準樣品的研制*

陳偉珠1，2，謝全靈1，張怡評1，洪專1，方華1，洪碧紅1，易瑞灶1

（1.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005； 2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系，化學(xué)生物學(xué)福建省重點實驗室，福建廈門 361005）

研制4，9-脫水河豚毒素國家標準樣品。以河豚魚卵巢為原料，提取制備4，9-脫水河豚毒素，采用紅外光譜（IR）、高分辨質(zhì)譜和核磁共振譜（NMR）進行結(jié)構(gòu)確證。樣品分裝成140瓶后，采用柱后衍生-高效液相熒光法進行均勻性、穩(wěn)定性檢驗和定值分析。從樣品中隨機抽取15瓶進行均勻性檢驗，經(jīng)F檢驗表明在95%的置信區(qū)間范圍內(nèi)樣品均勻性良好；穩(wěn)定性考察按照40℃加速試驗穩(wěn)定性（6個月）進行，結(jié)果表明在考察期間內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好；標準樣品經(jīng)國內(nèi)8家具有分析資質(zhì)的實驗室進行協(xié)同定值，并評定了定值結(jié)果的不確定度，4，9-脫水河豚毒素標準樣品定值結(jié)果為97.77%，相對擴展不確定度為0.4% (k=1.96)。該標準樣品達到國家標準樣品的技術(shù)要求，可用于有關(guān)脫水河豚毒素的方法校正和質(zhì)量控制。

4，9-脫水河豚毒素；標準樣品；柱后衍生-高效液相熒光色譜法；定值；不確定度

4，9-脫水河豚毒素(4，9-anhydrotetrodotoxin)是一種氨基全氫喹唑啉型化合物，與河豚毒素結(jié)構(gòu)極其相似，是河豚毒素的一種重要衍生物［1］，在自然界中與河豚毒素共存，主要存在于河豚魚的卵巢、肝臟、皮膚和腸胃中。4，9-脫水河豚毒素跟河豚毒素一樣，也是神經(jīng)細胞膜Na+通道的阻斷劑，其生理作用是可快速阻斷Na+通道，可廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)、生理學(xué)及其它科學(xué)研究。4，9-脫水河豚毒素的生物毒性比河豚毒素更弱，表現(xiàn)出更大的生物安全性，是一種具有廣闊藥用前景的化合物［2］。目前，國內(nèi)外未見4，9-脫水河豚毒素標準樣品研制的報道，也無4，9-脫水河豚毒素純品可以購買，限制了對4，9-脫水河豚毒素的深入研究。4，9-脫水河豚毒素國家標準樣品的研制，能解決海洋天然活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)近似的河豚毒素衍生物化合物難以分離的共性技術(shù)問題，提供4，9-脫水河豚毒素純品實物樣品，為進一步的生物活性研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)，加速4，9-脫水河豚毒素的理論研究與應(yīng)用基礎(chǔ)研究進程，為海洋生物毒素藥源開發(fā)與藥用研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和重要依據(jù)。為此筆者研制了4，9-脫水河豚毒素標準樣品。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters Alliances 系列，（Waters 2695 separations Module，Waters 2475 Multi λFluorescence Detector，Waters Reagent Manager，Waters Temperation Control Module II，Waters Post Column Reaction Module），美國Waters 公司；

紫外可見分光光度計：HP-8452 型，美國惠普公司；

紅外光譜儀：Nicolet Ftir-670 型，美國Thermo Scientific 公司；

高分辨質(zhì)譜儀：Lct Premier TM XE 型，美國Waters公司；

天平：AL/104型，瑞士梅特勒-托利多集團；

純水機：Milli-Q型，美國Millipore公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

庚烷磺酸鈉：分析純，美國Regis Technologies公司；

實驗用水均來自Milli -Q 純水系統(tǒng)。

1.2 脫水河豚毒素樣品的制備

以河豚魚卵巢為原料，首先經(jīng)浸提、預(yù)過濾、膜分離、濃縮等步驟后獲得毒素粗品，然后再采用制備色譜分離、濃縮、結(jié)晶、干燥等精制方法獲得純度不小于97%的4，9-脫水河豚毒素。

1.3 定性分析

采用紅外吸收光譜、高分辨質(zhì)譜及核磁共振譜等對脫水河豚毒素標準樣品進行定性分析。

1.4 定值分析

標準樣品定值一般情況下采用技術(shù)有效、嚴謹認可的方法來完成。4，9-脫水河豚毒素的特定檢測方法未見相關(guān)報道。由于4，9-脫水河豚毒素與河豚毒素有類似的結(jié)構(gòu)，在NaOH溶液中加熱同樣能產(chǎn)生帶有熒光的物質(zhì)，可以利用熒光檢測器測定4，9-脫水河豚毒素的含量，因此選擇柱后衍生高效液相色譜-熒光法［3］進行測定。

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX C8(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：庚烷磺酸鈉的磷酸鹽緩沖液(庚烷磺酸鈉濃度為2.5 mmol/L，磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉濃度為0.03 mol/L)，流量為0.3 mL/min；熒光檢測波長：激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長為510 nm；進樣體積：10 μL；衍生試劑：4 mol/L氫氧化鈉；柱溫：28℃；檢測器：Waters 2475型熒光檢測器。

1.4.2 樣品溶液配制

打開蓋子后，往西林瓶里加適量的0.03% HAc溶液溶解，然后轉(zhuǎn)移到100 mL的容量瓶，再洗西林瓶5次，并將洗液轉(zhuǎn)移到量瓶中，稀釋至標線。然后按照上述的色譜條件進行純度檢測，每個樣品重復(fù)進樣3次。

1.5 均勻性檢驗

標準樣品均勻性是指特性量值在空間分布的均勻程度，它是對標準樣品總體空間分布的評價，是標準樣品的重要質(zhì)量指標之一。對同一批制備的脫水河豚毒素樣品進行分裝，每瓶標準樣品凈重為1.000 mg，共140瓶。按照GB/T 15000.3-2008［4］規(guī)定，本項目確定抽樣數(shù)目為15個，采用單因素多水平試驗方差分析法對4，9-脫水河豚毒素標準樣品進行純度均勻性檢驗，測定方法采用柱后衍生高效液相色譜-熒光法，每個樣品重復(fù)測定3次。檢測數(shù)據(jù)用方差分析法進行分析以判斷標準樣品的均勻性是否合格。

1.6 穩(wěn)定性檢驗

為了考察樣品的穩(wěn)定性，確定其有效期，取本標準樣品模擬上市包裝，在溫度為(40±2)℃、相對濕度為75%±5%的條件下進行加速試驗6個月。分別于1、2、3、6個月取樣，在1.4.1色譜條件下進行檢測，考察其樣品純度的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫水河豚毒素的定性分析

脫水河豚毒素通過紅外吸收光譜、高分辨質(zhì)譜及核磁共振譜進行定性分析。

4，9-脫水河豚毒素的結(jié)構(gòu)式見圖1。對該樣品進行核磁共振測試，核磁數(shù)據(jù)見表1。從表1可知，該化合物的各質(zhì)子、各碳的化學(xué)位移與文獻［5］數(shù)據(jù)基本一致，且質(zhì)子個數(shù)、碳原子個數(shù)與脫水河豚毒素的分子式一致。

圖1 脫水河豚毒素的結(jié)構(gòu)式

表1 脫水河豚毒素的核磁共振數(shù)據(jù)

樣品的紅外光譜說明結(jié)構(gòu)中存在羥基、胺基、胍和亞甲基等，與脫水河豚毒素的官能團一致。高分辨質(zhì)譜測得該樣品的精確質(zhì)量數(shù)為302.097 1，與脫水河豚毒素的質(zhì)子加合峰一致（理論值C11H16N3O7［M+H］+302.098 8）。綜上所述，可以確證該樣品是脫水河豚毒素。

2.2 均勻性試驗

標準樣品的均勻性檢驗是標準樣品研制過程中不可缺少的程序。因此在對樣品進行分裝后，對4，9-脫水河豚毒素標準樣品進行純度均勻性檢驗，均勻性檢驗結(jié)果見表2與表3。

表2 脫水河豚毒素標準品純度均勻性檢驗結(jié)果 %

表3 方差分析結(jié)果

F(0.05，14，30)＝2.04，由表3可知，F(xiàn)＜F(0.05，14，30)，說明在95%的置信區(qū)間4，9-脫水河豚毒素樣品均勻性良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗

按1.6進行穩(wěn)定性重點考察項目檢測試驗，結(jié)果見表4。

表4 加速試驗結(jié)果

采用直線模型作為經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，?，9-脫水河豚毒素長期穩(wěn)定性獲得的數(shù)據(jù)進行分析。

直線的斜率：

直線的截距：

直線上點的標準偏差：

與斜率相關(guān)的不確定度：

自由度為n-2和P＝0.95(95%置信水平)的t因子t0.95，n-2＝3.18。

t0.95，n-2·s(b1)＝ 3.18×0.006 248＝ 0.019 619，由于|b1|＜t0.95，n-2·s(b1)，故斜率不顯著，因而未觀測到不穩(wěn)定性，說明經(jīng)(40±2)℃、相對濕度(75±5)%加速試驗樣品穩(wěn)定性良好。

參照藥典的說明，如果樣品在加速試驗條件下(30～40℃，RH＝75%，3個月)，各項質(zhì)量仍然良好，可初步確定其穩(wěn)定性為2年。因此將4，9-脫水河豚毒素國家標準樣品的最終有效期暫定為2年。

2.4 定值結(jié)果及其不確定度評定

2.4.1 定值結(jié)果

4，9-脫水河豚毒素標準樣品按照GB/T15000.3-2008［4］標準要求，采用多個實驗室協(xié)作定值，選擇獲得國家或部門認可的具備資質(zhì)的8家實驗室進行樣品定值。隨機抽取8瓶樣品，每個定值實驗室送1瓶，采用柱后衍生高效液相色譜熒光法進行測定，應(yīng)用面積歸一法進行定量，定值結(jié)果見表5。

表5 8家實驗室定值結(jié)果 %

匯集各家實驗室的檢測數(shù)據(jù)后，對每家實驗室的數(shù)據(jù)按大小順序排列，用Grubb’s法和峰度法正態(tài)性檢驗組內(nèi)數(shù)據(jù)的異常值，結(jié)果沒有異常值。所有數(shù)據(jù)進行下一步統(tǒng)計，用Grubb’s法對每家實驗室的平均值進行檢驗，將其看成一組測定值進行異常值檢驗，經(jīng)檢驗無異常值。因此將各家實驗室測得的數(shù)據(jù)作為無偏估計值，計算8家測定結(jié)果的平均值及標準偏差。然后對各實驗室測定結(jié)果的標準偏差S進行Cochran檢驗，計算統(tǒng)計量：

式中：Si——各實驗室測定結(jié)果的標準偏差；

Smax——Si中的最大值。

C8，6(0.05)＝0.360，C＞C8，3(0.05)，表明各實驗室間的測量不屬于等精度測量，因此計算加權(quán)平均值作為最佳值得到脫水河豚毒素標準樣品的定值結(jié)果?？偲骄礨＝97.77%。

2.4.2 定值結(jié)果的不確定度評定

根據(jù)GB/T 15000.3-2008標準規(guī)定，定值結(jié)果由標準值和不確定度組成。標準樣品特性標準值的測量不確定度u由標準值定值實驗引入的不確定度u(X)、均勻性檢驗引入的不確定度ubb和穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度ults組成。依據(jù)全部測定結(jié)果，計算4，9-脫水河豚毒素標準樣品的特性標準值和不確定度。

（1）標準值定值試驗引入的不確定度u(X)。按照加權(quán)法計算得到標準樣品定值的不確定度u(X)=0.19%。

（2）均勻性檢驗引入的不確定度ubb。瓶間方差：

式中：MSamong——組間均方差，來自表3；

MSwithin——組內(nèi)均方差，來自表3。

則均勻性檢驗引入的不確定度：

（3）穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度ults。由2.3穩(wěn)定性檢驗試驗可知，穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度：

標準樣品定值結(jié)果的不確定度：

擴展不確定度：

4，9-脫水河豚毒素標準樣品的定值結(jié)果：97.77%±0.40%(k＝1.96)。

3 結(jié)語

研制了4，9-脫水河豚毒素標準樣品脫水河豚毒素標準樣品，對其進行了均勻性檢驗、穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明該標準樣品符合標準樣品均勻性與穩(wěn)定性的要求。研制的4，9-脫水河豚毒素標準樣品對食品安全、環(huán)境監(jiān)測、衛(wèi)生檢驗檢疫等方面的測量和科學(xué)研究提供了技術(shù)支撐和量值溯源保證，具有重要意義。

［1］Toshio Nakagawa，Junho Jang，Mari Yotsu-Yamashita. Hydrophilic interaction liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry of tetrodotoxin and its analogs ［J］. Analytical Biochemistry，2006，352: 142-144.

［2］謝全靈，易瑞灶，許晨，等.高純脫水河豚毒素的結(jié)構(gòu)表征與毒力測定研究［J］.中國海洋藥物，2009，28(5): 21-24.

［3］陳偉珠，洪專，張怡評，等.河豚毒素的高效液相/熒光精確定量技術(shù)研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗，2009，19(2): 261-262.

［4］GB/T 15000.3-2008 標準樣品工作導(dǎo)則（3） 標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法［S］.

［5］Takeshi Y，Mari Y，Michio M. New tetrodotoxin analogues from the newt cynopsensicauda［J］. J Am Chem Soc，1988，110: 2 344-2 345.

Development of Anhydrotetrodotoxin Certified Reference Material

Chen Weizhu1，2， Xie Quanling1， Zhang Yiping1， Hong Zhuan1， Fang Hua1，Hong Bihong1， Yi Ruizao1
(1. The Third Institute of Oceanography of the State Oceanic Administration， Xiamen 361005， China； 2. Department of Chemistry and Key Laboratory Chemical Biology of Fujian Province， Xiamen University， Xiamen 361005， China)

4，9-anhydrotetrodotoxin certified reference material was developed. 4，9-anhydrotetrodotoxin was made from the ovarium of pufferfish. The structure of anhydrotetrodotoxin certified reference material was comfirmed by mass spectrometry and NRM，infrared spectroscopy (IR). 4，9-anhydrotetrodotoxin was divided into 140 bottles. The homogeneity and stability testing and quantitative analysis were evaluated by post column derivation high performance liquid chromatography-fluorescent detection (HPLC-FLD) method. According to analysis procedure of homogeneity，15 bottles of sample were randomly taken from 140 bottles，and the results were validated by F-test statistical method. The stability inspection was carried on the short-term(6 months)，and the results indicated that the period for anhydrotetrodotoxin of storage was 6 months at 40℃. A cooperative certification was conducted with 8 qualified laboratories. The certified purity value of the reference material of 4，9-anhydrotetrodotoxin was 97.77% with relative expaned uncertainty of 0.40%(k=1.96). The reference material can conform to the technical requirement of the certified reference material. The material was intended for use in the method validation and quality control regarding anhydrontetrodotoxin.

4，9-anhydrotetrodotoxin; certified reference material; post column derivation-HPLC-FLD; certification; uncertainty

O652.3

A

1008-6145(2014)03-0001-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2014.03.001

*廣東海洋經(jīng)濟發(fā)展區(qū)域示范項目(GD2012-D01-001)；海洋生物產(chǎn)業(yè)化中試技術(shù)研發(fā)公共服務(wù)平臺（12PZP001SF10）；廈門市重大科技創(chuàng)新平臺項目(3502Z20111001)；國家科技支撐計劃（NO.2011BAK04B09）

聯(lián)系人：洪專；E-mail: hzh@tio.org.cn

2014-02-12