彭 維, 歐愛芬

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州 510182;2.廣州市藥品檢驗(yàn)所)

(技術(shù)方法欄目編輯:張 健)

量子點(diǎn) (Quantum Dots，QD)，又稱半導(dǎo)體納米晶體，能夠接受激發(fā)產(chǎn)生熒光，因此，實(shí)際上是一種探針[1]。目前，在生物學(xué)領(lǐng)域QD應(yīng)用較多的是Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的納米微粒[2]。鏈霉親和素(streptavidin，SA)又稱鏈霉抗生物素蛋白，具有高度的親和力，其功能類似親和素。生物素-親和素系統(tǒng)(Biotin-Avidin System，BAS)有以下特征[3]:生物素與親和素具有高度的特異的親和性，橋聯(lián)作用和多級(jí)放大作用。在量子點(diǎn)表面標(biāo)記SA，利用生物素-親和素系統(tǒng)，將制備得到的CdTe-SA標(biāo)記物與生物素化的抗體、核酸、受體結(jié)合，就可把量子點(diǎn)標(biāo)記到細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)上，進(jìn)行示蹤檢測(cè)和功能研究。本研究以量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素為標(biāo)記試劑，將生物素-親和素系統(tǒng)應(yīng)用于熒光免疫分析中，建立了一種快速測(cè)定金黃葡萄球菌的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.1 長(zhǎng)臂生物素的活化 生物素的分子量較小，預(yù)先活化后，可使生物素噻吩環(huán)的戊酸側(cè)鏈上的羧基與抗體、酶等生物大分子以酰胺鍵偶聯(lián)。由于生物素與抗體或酶結(jié)合后極易受到大分子蛋白空間位阻效應(yīng)(sterichindrance)的影響，使用長(zhǎng)臂生物素可以減少位阻效應(yīng)，提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度[4]。長(zhǎng)臂生物素是在生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間添加2分子6-氨基己糖，活化生物素的制備是獲得高敏感度BAS制劑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。長(zhǎng)臂活化生物素(BCNHS)的制備過程分為兩步:先制成生物素，再合成長(zhǎng)臂生物并使其活化。

1.1.1 生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(biotinyl-N-hydroxy-succinnimide，BNHS)的制備:⑴取生物素1g混懸于12ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌均勻，分別加入0.6g N-羥基丁二酰亞胺(HOSU)和0.8g二環(huán)己基碳二亞胺(DCC);⑵將上述溶液置于密閉容器內(nèi)，錫紙包裝避光，室溫下磁力攪拌過夜;⑶0.45μm濾紙過濾，取濾液保存靜止30min;⑷濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加10ml乙醚洗滌瓶底;⑸繼續(xù)加200ml異丙醇使其重結(jié)晶，獲得的白色粉末狀晶體，既是BNHS。

1.1.2 長(zhǎng)臂活化生物素(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS)的制備:⑴稱取BNHS 341mg,6-氨基己糖鹽酸鹽200mg，溶解于5ml DMF，攪拌均勻;⑵加入0.152ml三乙胺(TEA)，室溫?cái)嚢柘伦饔?0h;⑶旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)去除DMF，加lmmol/L NaOH 3ml，繼加甲醇至溶液變清，勻速攪拌2h。蒸發(fā)去甲醇，加10ml蒸餾水，攪拌下滴加濃鹽酸酸化至剛果紅指示劑恰好變色;⑷室溫靜置2h后，入4℃冰箱過夜保存;⑸收集白色固體物，干燥后用水重結(jié)晶，再經(jīng)真空干燥，所得物即為長(zhǎng)臂生物素。

1.1.3 長(zhǎng)臂生物素的活化:稱取長(zhǎng)臂生物素357mg溶于10ml DMF中，加130mg HOSU和適量縮合劑，室溫?cái)嚢柘伦饔?8h。濾紙過濾，收集濾液蒸發(fā)完全，加乙醚洗滌后，用10-15ml無水異丙醇重結(jié)晶，所得粉末狀固體即為活化長(zhǎng)臂生物素。

1.2 長(zhǎng)臂生物素結(jié)合物的制備 ⑴無水二甲亞砜(DMSO)配制l0mg/ml長(zhǎng)臂生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液。⑵硼酸鹽緩沖液(0.1mol/L，pH8.8)配制濃度為1mg/ml的金黃葡萄球菌IgY抗體溶液。⑶按4:1的比例將生物素酯加入金黃葡萄球菌IgY抗體溶液中，混合均勻并在室溫下孵育4h。在結(jié)合反應(yīng)完成之前DMSO的終濃度不能低于5%，否則生物素酯會(huì)出現(xiàn)沉淀。⑷將生物素結(jié)合金黃葡萄球菌IgY抗體溶液用PBS緩沖液透析，以除去未結(jié)合的生物素。由于生物素分子較大，故透析時(shí)間盡量較長(zhǎng)，以純化生物素化抗體溶液。

1.3 生物素化抗體的紫外分光檢測(cè) 將1.2項(xiàng)制備好的生物素化抗體溶液，通過紫外分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描測(cè)定制備的生物素化抗體的最大吸收峰值，同時(shí)比較金黃葡萄球菌IgY抗體的紫外掃描圖片。

1.4 生物素化抗體的凝膠電泳鑒定 使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)對(duì)生物素化抗體的純度進(jìn)行鑒定。

1.5 量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素的透視電鏡檢測(cè) 取少許的量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素溶液，透射電鏡掃描，觀察量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素的制備效果。

1.6 量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素的熒光光譜檢測(cè) 取少許量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素溶液，熒光光譜掃描測(cè)定，觀察量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素發(fā)射光譜及最大吸收峰。

1.7 量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素免疫檢測(cè)方法的建立 ⑴取金黃葡萄球菌抗原用PBS緩沖液稀釋至108cfu/ml，包被96孔板，每孔加100μl 的金黃色葡萄球菌抗原，4℃過夜;⑵傾去包被液，PBST洗滌三次，每次在吸水紙上拍干，每孔加入150μl 5%的脫脂牛奶(溶于PBST)，37℃封閉孵育40min;⑶傾去封閉液，PBST滿孔洗滌三次，每次在吸水紙上拍干;⑷每孔依次加入100μl不同濃度的金黃葡萄球菌溶 液(1×l010cfu/ml，1×l09cfu/ml，1×l08cfu/ml，1×l07cfu/ml，1×l06cfu/ml，1×l05cfu/ml，1×l04cfu/ml，1×l03cfu/ml)和100μl生物素化金黃葡萄球菌IgY抗體溶液，震蕩均勻后，37℃孵育1h;⑸PBST洗滌 3 次，每次在吸水紙上拍干;(6)每孔加入100μl QDs-SA復(fù)合物溶液，37℃孵育40min，洗滌3次并甩干，使用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光信號(hào)強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為350nm、485nm)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法確定樣品中金黃葡萄球菌的含量，每次平行測(cè)定三組數(shù)據(jù)取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物素化抗體的紫外分光檢測(cè)結(jié)果 金黃葡萄球菌IgY抗體溶液的吸收峰在280nm處發(fā)生了位移，表明生物素成功標(biāo)記到了金黃葡萄球菌IgY抗體上(圖1)。

圖1 生物素化抗體和金黃葡萄球菌IgY抗體溶液的紫外可見光譜圖

2.2 生物素化抗體凝膠電泳鑒定結(jié)果 生物素標(biāo)記金黃色葡萄球菌IgY抗體SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖2:金黃色葡萄球菌IgY在22.0-30.0kDa和67.0-70.0kDa相對(duì)分子質(zhì)量處有兩條清晰的蛋白帶，分別為IgY的輕鏈和重鏈，標(biāo)記后顯示生物素化抗體分子量略高于IgY抗體，初步表明標(biāo)記成功。

2.3 量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素的透視電鏡檢測(cè)結(jié)果 偶聯(lián)鏈霉親和素的CdS量子點(diǎn)仍以單分散形式存在，形態(tài)均勻、呈球形，量子點(diǎn)之間沒有發(fā)生團(tuán)聚，分散性較好，粒徑大小約為8-10nm，較CdS量子點(diǎn)稍大。

2.4 量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素的熒光光譜檢測(cè)結(jié)果 用于免疫熒光探針的QDs-SA的激發(fā)光譜較寬且連續(xù)分布，在350nm激發(fā)光下的熒光發(fā)射光譜較窄，熒光強(qiáng)度較大，最大發(fā)射峰在485nm處。

圖2 SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果

2.5 量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素免疫檢測(cè)方法的建立 量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素免疫檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果顯示在1×l010cfu/ml-1×l04cfu/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性相關(guān)，線性回歸方程為y=1.6786x－1.7786，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9942，根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的建議，通過計(jì)算得到對(duì)金黃色葡萄球菌檢出限濃度為2.7×104cfu/ml。通過對(duì)1×l010cfu/ml和1×l04cfu/ml的金黃葡萄球菌進(jìn)行8次平行測(cè)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，量子點(diǎn)標(biāo)記檢測(cè)方法顯色后24h之內(nèi)其熒光信號(hào)變化較小，穩(wěn)定性高。

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)通過建立量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素免疫檢測(cè)金黃葡萄球菌方法，結(jié)果顯示金黃葡萄球菌的濃度在1×l010cfu/ml-1×l04cfu/ml濃度范圍內(nèi)，相對(duì)熒光強(qiáng)度有良好的線性相關(guān)，其檢出限濃度為2.7×104cfu/ml，量子點(diǎn)標(biāo)記檢測(cè)方法顯色后24h之內(nèi)其熒光信號(hào)變化較小，穩(wěn)定性高，為檢測(cè)金黃葡萄球菌提供新的有效方法。

[1]邵君，尤曉剛，高峰，等.量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素及其生物活性檢測(cè)[J].分析化學(xué)，2006,34(11):1625-1628.

[2]任國(guó)蘭,柴宜民,韓素琴,等.II-VI型量子點(diǎn)在分析中的應(yīng)用[J].山西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,17(03):39-43.

[3]Kui Jiao,Shushen Zhang.Technology of immunoassay of ELISA and its application[M].Beijing,Chemical Industry Press,2004.94.

[4]錢建瑞,趙艷偉,梁艷,等.量子點(diǎn)標(biāo)記鏈霉親和素?zé)晒饷庖叻治鰷y(cè)定雌三醇[J].分析試驗(yàn)室，2009，28(6):104-106.