周 勇 張 健 楊斯涵 王皓然 楊亮宇 何云波

（1.云南農(nóng)業(yè)大學，云南昆明 650201 2.昆明市宜良縣匡遠畜牧獸醫(yī)站，云南昆明 650201）

武定雞是全國著名的地方雞種，屬肉用型，以體型大、肉質(zhì)鮮、外觀美等特點聞名，主要分布于云南省的武定、祿勸等地。當?shù)孛癖娫谄滹曫B(yǎng)過程中恪守“只向外賣雞，不向外買雞”的鄉(xiāng)規(guī)民約，使雞群長期處于自繁自養(yǎng)的封閉狀態(tài)。由于繁殖過程中自然環(huán)境的封閉和人為因素的干預，使其基因更具原始性和保守性，從而更能保留獨特的基因型。

馬立克氏?。∕D）是由皰疹病毒科B亞群馬立克氏病病毒（MDV）引起的雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病，與雞新城疫、傳染性法氏囊病并稱為危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的三大主要疫病。目前，MD主要防控措施是對雞進行MDV不同血清型疫苗的接種，但近年來MDV毒力不斷增強，已發(fā)現(xiàn)其超強毒株可以突破CVI988疫苗的保護，正如Kreager提出的每種MDV疫苗使用期只有10年。為彌補疫苗免疫的不足，許多學者對雞MD抗性基因進行了研究，發(fā)現(xiàn)主要組織相容性復合體（MHC）、生長素（GH）基因和數(shù)量性狀位點（QTL）等為其抗性基因。而我們在對武定雞易發(fā)病調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)時有MD出現(xiàn)且不同雞群發(fā)病情況差異明顯?；诖耍疚木湍壳把芯堪l(fā)現(xiàn)的MD抗性基因進行綜述，總結(jié)前人有效的檢測方法，為武定雞MD抗性相關(guān)基因的研究提供參考。

1 主要組織相容性復合體（MHC）

雞MHC亦稱B復合體[1]，分為B復合體和Rfp-y基因，位于第16號染色體，編碼能引起機體異體排斥反應(yīng)抗原系統(tǒng)的一組高度多態(tài)性的基因群。雞B復合體主要由B-F、B-L和B-G三個功能性基因組成，B-F和B-L所編碼的抗原在結(jié)構(gòu)和功能上分別類似于哺乳動物MHCⅠ類和Ⅱ類抗原，B-G抗原為禽類所特有。Bacon[2]在對雞群中不同MHC-B單倍型對MD抗性差異性研究過程中，發(fā)現(xiàn)對MD抗性最強的是B21單倍型，中等為B2和B6單倍型，易感為B9、B13和B15單倍型。

1.1 B-F基因

B-F基因編碼MHCⅠ類抗原，由α鏈基因組成。α鏈基因有八個外顯子包括：一個編碼信號序列外顯子；二個編碼胞外區(qū)外顯子；一個編碼轉(zhuǎn)膜區(qū)外顯子；二個參與編碼胞質(zhì)尾區(qū)外顯子以及3'-UTR區(qū)和5'-UTR區(qū)的編碼外顯子組成。雞B-F基因與細胞免疫關(guān)系密切，對MD、禽白血病、雞瘟等多種疾病有抗性[3]。

Briles等[4]以Cornell品種抗MD的N系和易感P系雞群作為研究對象，其中P系由B19和B13的單倍型組成，N系僅含B21單倍型。通過兩個品系的雜交F1代中B19/B21的母雞與B19/Bl9的公雞回交后，經(jīng)MDV攻毒后，發(fā)現(xiàn)其子代B19/B19的MD發(fā)病率約是B19/B21的三倍；將F1代中B19/B21的公雞與B19/Bl9的母雞回交后，經(jīng)MDV攻毒后，其子代B19/B19的MD發(fā)病率約是B19/B21的六倍。結(jié)果表明B21單倍型對MD的抗性遠高于B19單倍型。隨后，Briles等[5]又利用MDV強毒株對重組單倍型B19/B19、B19/B21和B19/BF21-G19的小雞攻毒，發(fā)現(xiàn)B19/B21和B19/BF21-G19的MD發(fā)生率遠低于B19/B19單倍型，表明B-F亞區(qū)是MD抗性基因。

后來，Rogers等[6]對位于B-F/L區(qū)域的NK細胞受體樣蛋白基因研究，認為其可作為MDV抗性的候選基因；Jin等[7]在對抗MD純合子霞煙雞B-F基因多態(tài)性分析時，利用RFLP技術(shù)分析了霞煙雞的B6、B19和B21單倍型，發(fā)現(xiàn)B21單倍型對MDV抗性最高，B6單倍型對MDV抗性相對較弱，B19單倍型對MDV抗性最弱，結(jié)果表明不同B單倍型對MDV抗性差異明顯；隨后Jin等[8]對不同單倍型的B-F1/B-F2基因序列測定比較中，發(fā)現(xiàn)序列中多態(tài)性主要表現(xiàn)在B-F基因的α1α2區(qū)域；左天榮[9]在對抗MD霞煙雞與非抗MD霞煙雞B-F基因序列的研究中，利用B-F基因的α1α2區(qū)域設(shè)計引物，并確定目的片段為567 bp，PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序后與Genbank公布的 B2、B6、B5、B13、B19、B21和B21-LIKE單倍型基因序列進行比較分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)堿基替換頻繁并呈高度多態(tài)性，并證明抗MD霞煙雞與非抗雞在此區(qū)域存在基因差異。

1.2 B-L基因

B-L基因編碼MHCⅡ類抗原，由α鏈和β鏈基因組成。α鏈基因無多態(tài)性；β鏈基因有豐富的多態(tài)性包括：一個編碼信號序列區(qū)外顯子；二個編碼細胞質(zhì)區(qū)外顯子；編碼非多態(tài)性β2免疫球蛋白的區(qū)域；編碼β蛋白和肽結(jié)合區(qū)的多態(tài)性區(qū)域以及3'-UTR區(qū)的編碼外顯子。雞B-L基因與體液免疫關(guān)系密切，對MD、球蟲病等多種疾病有抗性[3]。

Pharr等[10]通過對B-L基因表達的研究，證明不同品種同一品系B2、B5、B13、B15和B21單倍型雞的B-L基因表達程度不同，且對MD抗性也不相同，說明B-L基因多態(tài)性與MD抗性相關(guān)；Niikura等[11]通過對MDV不同編碼蛋白與宿主蛋白交互作用的研究，發(fā)現(xiàn)只有B-L基因的β鏈基因編碼的蛋白是與MDV有交互用，表明β鏈是決定MD抗性的主要影響因素。

隨著對雞B-F和B-L基因研究的深入，F(xiàn)ulton等[12]在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上進行了雞MHC分子基因型鑒定，通過多個研究機構(gòu)長期隔離培育的不同品系MHC純合子單倍型雞群為研究材料，對B-F和B-L基因區(qū)域間微衛(wèi)星位點LEI0258和MCW0371分別設(shè)計引物，通過其PCR產(chǎn)物不同來確定大多數(shù)標準單倍型。LEI0258的PCR目的片段從182到552 bp，與其對應(yīng)的個單倍型如圖1，MCW0371的PCR目的片段從200到209 bp。

圖1 LEI0258微衛(wèi)星位點PCR產(chǎn)物與部分單倍型

通過結(jié)合分析LEI0258和MCW0371微衛(wèi)星位點PCR目的產(chǎn)物，F(xiàn)ulton確定了雞的各主要標準單倍型，各單倍型目的片段大小詳見表1。而與MD抗性相關(guān)的B2、B6、B5、B13、B19和B21單倍型，也可以通過此法進行區(qū)分。

表1 LEI0258和MCW0371的PCR目的產(chǎn)物與各標準單倍型

1.3 B-G基因

B-G基因包括3'-UTR區(qū)、5'-UTR區(qū)和五個外顯子，其外顯子包括：一個編碼信號肽的外顯子；一個編碼胞外區(qū)顯子；一個編碼胞內(nèi)區(qū)外顯子；一個編碼跨膜區(qū)外顯子以及一個編碼鏈接區(qū)外顯子。由于雞紅細胞表面B-G抗原具有顯著的多態(tài)性，早期學者以血清型不同來鑒別單倍型的不同，并成功選育出了抗MD雞群。但B-G抗原只能協(xié)助MHC I和II類抗原進行體液免疫應(yīng)答無特定MD抗性，因此越來越多的學者已不再將其作為MD抗性基因。

1.4 Rfp-y基因

Rfp-y基因與B復合體相似，二者雖然位于同一條染色體上，但無遺傳上的聯(lián)系。Tanja等[13]在對黑琴雞Rfp-y基因研究時，發(fā)現(xiàn)Rfp-y基因表達量的不同對腫瘤發(fā)生率有影響，由此推斷Rfp-y基因可能與MD抗性相關(guān)。但在Cornell品種抗MD的N系和易感P系雞群及其他幾個品種中，并未表現(xiàn)出Rfp-y基因?qū)δ[瘤發(fā)生率的影響。因此，Rfp-y基因與MD抗性是否有關(guān)尚無明確定論。

2 生長素（GH）基因

雞GH基因由五個外顯子和四個內(nèi)含子組成，外顯子穩(wěn)定而內(nèi)含子易突變，故推測內(nèi)含子是其表達的主要影響因素。GH有促進雞生長發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)的作用，研究發(fā)現(xiàn)MDV抗性雞體型通常較小，表明GH分泌水平有可能與MDV復制或腫瘤的形成相關(guān)。Liu[14]利用酵母雙雜交試驗、免疫組織試驗和間接免疫熒光試驗證實GH基因與MD抗性相關(guān)；Sarson等[15]在對MD抗性和易感雞的GH基因轉(zhuǎn)錄分析時，發(fā)現(xiàn)GH基因表達存在差異，并由此推斷其為MD抗性基因，但對MD抗性有多大，仍需要進一步研究。

3 數(shù)量性狀位點（QTL）

QTL是指一個性狀由多個基因決定，每個基因?qū)Υ诵誀钣绊懚际俏⑿У?。McElrov等[16]利用2個MD病死率不同的雞群雜交得到F1代，再將F1代回交，對F1代回交得到的雞群經(jīng)MD疫苗免疫后，通過選擇性DNA池技術(shù)選出81個微衛(wèi)星位點進行測定，發(fā)現(xiàn)了17個與MD抗性有關(guān)的微衛(wèi)星位點；Heifetz等[17]在對包括雞2/3基因圖譜的198微衛(wèi)星位點研究時，發(fā)現(xiàn)了15個與MD抗性相關(guān)的非MHC染色體區(qū)域，它們分別位于1、2、3、4、5、7、8和9號染色體以及Z染色體上。

4 其他基因

Li等[18]通過對MD易感雞與抗性雞的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因進行酶切，得到7個等位基因型出現(xiàn)頻率存在差異；Kaiser等[19]通過對ADOL品系MD易感和抗性雞脾細胞中IL-6和IL-18的mRNA表達水平的研究，發(fā)現(xiàn)易感雞表達水平遠高于抗性雞，表明IL-6和IL-18與MD抗性密切相關(guān)；Fei等[20]通過對RCS品系MD易感和抗性雞感染MDV后，發(fā)現(xiàn)易感雞與抗性雞的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因3a和3b表達量存在差異，說明它們可能與MD抗性相關(guān)。但上述結(jié)果是否適應(yīng)于雞的大多數(shù)品種，還有待研究。

5 結(jié)語

與雞MD抗性相關(guān)的多個基因中，MHC的B-F和B-L基因無疑是MD抗性最主要的影響因素，非MHC基因?qū)D抗性通常僅表現(xiàn)在幾個雞群中且同一基因在不同品系中差別較大。因此，先前的學者也都將研究重點放在了B-F和B-L基因上，特別是Fulton通過B-F和B-L基因區(qū)域間微衛(wèi)星位點PCR產(chǎn)物來區(qū)分不同的單倍型，為我們研究武定雞MD抗性相關(guān)基因提供了新思路。但研究者們往往只注重對其中一個基因的研究，同時又常忽略非MHC基因的影響，對雞MD抗性相關(guān)基因的認識始終沒有形成一個完整的體系。由此可知，綜合考慮各相關(guān)基因?qū)D抗性的影響將是下一步研究趨勢，而武定雞由于其品種和生長環(huán)境的獨特性，以其作為研究對象更有生物學意義。

[1]Michael S，Indrajit N，David W B. First report on chicken genes and chromosomes. Cytogenetics and Cell Genetics[J]. Cytogenetics and Cell Genetics. 2000，（90）：169-218.

[2]Bacon L D，Hunt H D，Cheng H H. Genetic resistance to Marek’s disease[J]. Curr Top MicrobiolImmunol. 2001，（255）：121-141.

[3]牛成明. MHC特異單倍型SPF雞群的建立及其對MD抗性的研究[D].黑龍江：哈爾濱獸醫(yī)研究所，2009.

[4]Briles W E，Stone H A，Cole R K. Marek's disease：Effects of B histocompatibility alloalleles in resistance and susceptible chicken lines[J]. Science. 1977，（195）：193-195.

[5]Brelis W E，Brelis R W，Taffs R E，et al. Resistance to a malignant lymphoma in chickens is mapped to subregion of major histocompatibility（B）complex[J]. Science. 1983，（219）：977-979.

[6]Rogers S L，Kaufman J. High allelic polymorphism moderate sequence diversity and diversifying selection for B-NK but not B-lec，the pair of lectin-like receptor genes in the chicken MHC[J]. Immunogenetics.2008，（60）：461-475.

[7]Jin Y C，Coudert F，Wei P，et al. Marek's disease resistant MHC haplotypes in Xiayan chickens identified on the basis of BLB2PCRRFLP and BLB2/BF2sequence analyses[J]. British Poultry Science.2010，（4）：530-539.

[8]Jin Y C，Wei P，Niu B X，et al. Studies on the association of BF1/BF2gene expression patterns with traits of genetic resistance to Marek’s disease in chickens[J]. Food and Agricultural Immunology. 2013，（2）：1-9.

[9]左天榮.廣西三黃雞抗馬立克氏病相關(guān)基因篩選的初步研究[D].廣西：廣西大學，2005.

[10]Pharr G T，Godgson J B，Hunt H D，et al. Class II MHC cDNAs in 15I5 B-congenic chickens[J]. Immunogenetics.1998，47（5）：350-354.

[11]Niikura M，Liu H C，Dodgson J B，et al. A Comprehensive Screen for Chicken Proteins That Interact with Proteins Unique to Virulent Strains of Marek's Disease Virus[J]. Poultry Science. 2004，（83）：1117-1123.

[12]Fulton J E，Juul-Madsen H R，Ashwell C M，et al. Molecular genotype identification of the Gallus gallus major histocompatibility complex[J]. Immunogenetics. 2006，58（5-6）：407-421.

[13]Tanja Strand，Helena Westerdahl，et al. The MHC class II of the Black grouse（Tetrao tetrix）consists of low numbers of B and Y genes with variable diversity and expression[J]. Immunogenetics.2007，59（9）：725-734.

[14]Liu H C. Growth hormone interacts with the Marek's disease virus SORF2 protein and is associated with disease resistance in chicken[J].PANS. 2001，98（16）：9203-9208.

[15]Sarson A J，Parvizi P，Lepp D，et al. Transcriptional analysis of host responses to Marek’s disease virus infection in genetically resistant and susceptible chickens[J]. Animal Genetics. 2008，（39）：232-240.

[16]McElrov J P，Dekkers J C，F(xiàn)ulton J E. Micro satellite markers associated with resistance to Marek's disease in commercial layer chickens[J]. Poultry Science. 2005，（84）：1678-1688.

[17]Heifetz E M，F(xiàn)ulton J E，O'Sullivan N P，et al. Mapping Quantitative Trait Loci Affecting Susceptibility to Marek's Disease Virus in a Backcross Population of Layer Chickens[J]. Genetics.2013，（3）：217-223.

[18]Li S，Zadworny D，Aggrey S E，et al. Mitochondrial PEPCK：a highly polymorphic gene with alleles co-selected with Marek's disease resistance in chickens[J]. Animal Genetics. 1998，（29）：395-397.

[19]Kaiser P，Underwood C，Davison F. Differential cytokine responses following Marek's Disease virus infection of chickens differing in resistance to Marek's Disease[J]. Tourttal of Virology. 2003，77（1）：762-768.

[20]Fei Tian，F(xiàn)ei Zhan，Nathan D VanderKraats，et al. DNMT gene expression and methylome in Marek's disease resistant and susceptible chickens prior to and following infection by MDV[J]. Epigenetics.2013，（10）：431-444.