陳 娟 羅 艷 吳春燕 馬 巖 楊俊華
(1.寧夏獸藥飼料監(jiān)察所,寧夏銀川 750011;2.寧夏農(nóng)墾農(nóng)林牧技術(shù)推廣服務(wù)中心,寧夏銀川 750011)
氯霉素類藥物是一種廣譜抑菌性抗生素,對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌都有作用,臨床是治療傷寒桿菌、副傷寒桿菌、沙門氏菌感染的首選藥。代表性藥物主要有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考。由于氯霉素會(huì)抑制骨髓造血功能,造成再生障礙性貧血,所以,很多國家都已經(jīng)禁止在食用性動(dòng)物上使用氯霉素。甲砜霉素不產(chǎn)生再生障礙性貧血,但抑制紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板的生成。歐盟、美國禁用于食品動(dòng)物。氟苯尼考抗菌活性優(yōu)于氯霉素、甲砜霉素,對(duì)氯霉素耐藥的菌株仍敏感不引起骨髓抑制或再生障礙性貧血,但有胚胎有毒性,妊娠動(dòng)物禁用,在雞肉中的殘留限量為100 μg/kg。本研究擬采用LC-MS/MS方法建立雞肌肉中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考3種藥物的多殘留檢測(cè)方法,以期為該類藥物的殘留監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。
ACQUITY UPLC-Xevo TQ超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀,Waters公司;AE-205電子天平,Mettler Toledo公司;CT15RT高速冷凍離心機(jī),日立公司;Organomation Associates 氮吹儀,Jnc公司;MS1旋渦合器,IKA公司;LR4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,Heidolph公司。
對(duì)照品:氯霉素、氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)物,純度大于95%,Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;甲砜霉素、氟苯尼考,純度大于95%,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;甲醇為Fisher公司;乙酸乙酯為色譜純;正己烷為色譜純;水為超純水;氨水為分析純。
精密稱取氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考對(duì)照品各10 mg,分別置100 ml容量瓶中,甲醇溶解并稀釋成100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;分別準(zhǔn)確吸取三種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,置于10 ml容量瓶中,用甲醇稀釋成適宜濃度的中間混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確吸取適量氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液,用甲醇稀釋成適宜濃度的中間濃度內(nèi)標(biāo)溶液。
準(zhǔn)確吸取適量中間混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和中間濃度內(nèi)標(biāo)溶液,用空白樣品提取液配成系列濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,氯霉素系列濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L,甲砜霉素和氟苯尼考系列濃度為2.0、4.0、8.0、20.0、40.0 μg/L,內(nèi)標(biāo)物濃度為5 μg/L。從低濃度到高濃度測(cè)定,每一濃度進(jìn)樣3針,以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
色譜柱為Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相A為甲醇,B為水,梯度洗脫:0~6 min,10%A線性變化至90%A;6~7 min,90%A線性變化至10%A,保持1.9 min。流速0.3 ml/min,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量10 μl。
質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI-),毛細(xì)管電壓2.8 KV,源溫150 ℃,脫溶劑氣溫度400 ℃,霧化氣流速1 000 L/h,錐孔氣流速50 L/h。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)各離子對(duì)及對(duì)應(yīng)錐孔電壓、碰撞能量見表1。
表1 3種藥物的定性、定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量
準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的試料(2+0.05)g,置于50 ml離心管內(nèi),加入20 ng/ml D5-氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液250 μl,加入乙酸乙酯15 ml,再加入0.45 ml氨水,5 g無水硫酸鈉,旋渦混勻,超聲提取5 min,5 000 r/min離心5 min,取上清液于雞心瓶中,重復(fù)提取一次,合并提取液于雞心瓶看,45℃旋轉(zhuǎn)蒸干。殘留物用1 ml水溶解,再加入3 ml正己烷旋渦混合30 s,靜置分層。棄去上層正己烷,再加入3 ml正己烷旋渦混合30 s,靜置分層,移取下層水相于1.5 ml離心管中,以13 000 r/min離心5 min,過0.2 μm濾膜后,供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。
準(zhǔn)確量取適量的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,制得濃度為0.5、1、2、5、10 μg/L氯霉素基質(zhì)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液(內(nèi)標(biāo)濃度為5 μg/L)、甲砜霉素及氟苯尼考基質(zhì)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液2、4、8、20、40 μg/L(內(nèi)標(biāo)濃度為5 μg/L),依次上機(jī)測(cè)定,以各藥物定量離子質(zhì)量色譜峰面積與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(y),標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性方程(表2)。三種藥物在系列濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。
圖1 甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖2 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖3 氯霉素素標(biāo)準(zhǔn)曲線
表2 3種藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)
在空白雞肌肉中添加氯霉素0.25 ug/kg、0.5 ug/kg、1 ug/kg及甲砜霉素、氟苯尼考1 ug/kg、2 ug/kg、4 ug/kg 3個(gè)不同濃度進(jìn)行回收率試驗(yàn),結(jié)果匯總見表3。可以看出,氯霉素的平均回收率為94.0%~96.9%,批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%;甲砜霉素平均回收率為87.4%~98.2%,批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%;氟苯尼霉平均回收率為99.5%~103%,批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。
圖5 0.25ng/g(1ng/g)空白雞肌肉添加3種藥物的特征離子質(zhì)量色譜圖
表3 空白雞肌肉中添加3種藥物的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定雞肉中3種氯霉素類藥物,方法線性、回收率和精密度等得到參數(shù)均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。
[1]孫雷,張?bào)P,王樹槐,等.超高效液相色譜法—串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物源食品中氯霉素類藥物及其代謝物殘留[J].中國獸藥雜志.北京:2009,43(3):42-45.
[2]陳小霞,岳振峰,吉彩霞.高效液相色譜-電噴霧電離三級(jí)四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定雞肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的殘留量[J].色譜,2005,(1):92-95.
[3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》[S].2002.