復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)乳腺研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)產(chǎn)生XCL1可促進(jìn)乳腺癌耐藥細(xì)胞株的增殖

白玉盤(pán) 楊小利 歐周羅

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)乳腺研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

背景與目的：統(tǒng)計(jì)表明90%以上腫瘤患者的死亡與腫瘤耐藥相關(guān)，而在乳腺癌中常見(jiàn)PI3K/Akt/ mTOR信號(hào)通路的異常激活，以此通路為靶點(diǎn)的藥物已成為乳腺癌治療的研究熱點(diǎn)。本研究主要分析C族趨化因子配基1(C chemokine ligand 1，XCL1)對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞增殖的影響及其產(chǎn)生機(jī)制。方法：建立吉西他濱耐藥性人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231/Gem。采用CCK8檢測(cè)MDA-MB-231和MDA-MB-231/Gem的增殖能力，RT-PCR、ELISA檢測(cè)2株細(xì)胞株XCL1表達(dá)差異，Western blot檢測(cè)mTOR的表達(dá)。結(jié)果：與MDA-MB-231相比，MDA-MB-231/ Gem的增殖能力增強(qiáng)，XCL1在耐藥細(xì)胞株表達(dá)增強(qiáng)。mTOR在耐藥細(xì)胞株表達(dá)水平及磷酸化水平增強(qiáng)。在MDAMB-231中加入外源性XCL1 24 h后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。而在MDA-MB-231/Gem中加入抗XCL1抗體后，細(xì)胞增殖能力降低。mTOR抑制劑處理MDA-MB-231/Gem后，細(xì)胞增殖能力降低，XCL1產(chǎn)生減少。結(jié)論：趨化因子X(jué)CL1的分泌可促進(jìn)乳腺癌耐藥細(xì)胞的增殖并由mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)產(chǎn)生。

MDA-MB-231/Gem；趨化因子配基1；mTOR；乳腺癌

惡性腫瘤已成為人類的第一殺手，嚴(yán)重危害人類的生命健康。今后20年內(nèi)全球癌癥患者人數(shù)還將快速上升。目前，化療是治療腫瘤的主要途徑之一，然而腫瘤耐藥往往造成化療失敗，從而導(dǎo)致患者病情惡化甚至死亡［1-2］。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，90%以上腫瘤患者的死亡與腫瘤耐藥相關(guān)。因此，如何克服腫瘤耐藥是成功治療惡性腫瘤急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一［3］。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可介導(dǎo)多種蛋白如HIF-1α等的產(chǎn)生。mTOR信號(hào)通路與人類多種腫瘤密切相關(guān)，其在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、凋亡、血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移以及對(duì)放化療抵抗中發(fā)揮重要作用［4-5］，乳腺癌中常見(jiàn)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的異常激活，以此通路為靶點(diǎn)的藥物已成為乳腺癌治療的研究熱點(diǎn)［5-6］。本研究應(yīng)用CCK8、PCR及Western blot等多種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了乳腺癌細(xì)胞和耐藥細(xì)胞株中C族趨化因子配基1(C chemokine ligand 1，XCL1)、mTOR的表達(dá)，并分析其與細(xì)胞增殖的關(guān)系及耐藥機(jī)制，旨在為乳腺癌臨床治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及試劑

1.1.1 細(xì)胞

化療抵抗乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231/ Gemcitabine(MDA-MB-231/Gem)由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺癌研究所建立。MDA-MB-231及MDA-MB-231/Gem細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%FBS。細(xì)胞傳代時(shí)用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

1.1.2 主要試劑

重組蛋白XCL1(購(gòu)自美國(guó)R&D公司)，mTOR和磷酸化mTOR抗體及mTOR磷酸化抑制劑(購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，ELISA試劑盒(購(gòu)自美國(guó)R&D公司)，RIPA裂解液(購(gòu)自中國(guó)碧云天公司)，PhosStop(購(gòu)自瑞士Roche公司)，BCA蛋白定量試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific Pierce公司)，TRIzol(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，凋亡試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)。

1. 2 主要儀器

Eppendorf 5417R高速冷凍離心機(jī)(購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司)，精宏電熱恒溫培養(yǎng)箱(購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，恒溫金屬浴振蕩器(購(gòu)自中國(guó)博日科技Bioer公司)，Bio-Rad恒流恒壓電泳儀(購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司)，ATTO AE-6450電泳槽(購(gòu)自日本ATTO公司)，UV-120-02型紫外分光光度儀(購(gòu)自日本島津公司)，Image quant Las 4000mini凝膠成像儀及Nanoview微量檢測(cè)儀(購(gòu)自美國(guó)通用電氣)，ESCO classⅡ生物安全柜(購(gòu)自新加坡ESCO公司)， Biotek ELX-800酶標(biāo)儀(購(gòu)自美國(guó)Biotek公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞總RNA的抽提

將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，用預(yù)冷的PBS洗1次，加入1 mL TRIzol(以能完全覆蓋整個(gè)細(xì)胞表面為宜)，反復(fù)吹打細(xì)胞然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendorf管(EP管)內(nèi)，將EP管放入冰盒里靜置5 min后，加入200 μL氯仿，振蕩15 s后，置于冰盒內(nèi)靜置2 min，隨后12 000×g、4 ℃離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管內(nèi)，并加入500 μL異丙醇，輕輕震蕩使管中液體混合均勻，靜置10 min，行12 000×g、4 ℃離心10 min，棄上清液。接著，加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇(用DEPC水配制)，輕輕洗滌沉淀，行7 500×g、4 ℃離心5 min，棄上清液，沉淀總RNA置室溫風(fēng)干5 min，隨后加入100 μL的DEPC水溶解。最后，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定RNA濃度，按照反應(yīng)體系需要，加入各種試劑，放入金屬浴內(nèi)反應(yīng)，去除其中的DNA酶。

1.3.2 RT-PCR反應(yīng)及產(chǎn)物鑒定

1.3.2.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

反應(yīng)體系總體積為20 μL，模板為從乳腺癌細(xì)胞抽提的總RNA。在EP管中分別加入試劑：4 μL 5×PrimeScriptBuffer PrimeScript，1 μL RT Enzyme Mix Ⅰ，1 μL Oligo dT Primer，1 μL Random 6 mers，2 μL RNA，11 μL DEPC H2O，輕輕震蕩使管中液體混合均勻，置于PCR儀(EppendofMastercycler pro S)內(nèi)，根據(jù)相應(yīng)的反應(yīng)條件，進(jìn)行cDNA合成。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.3.2.2 PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系總體積為20 μL。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物XCL1序列正義鏈：5’-GCTCTCTCACTGCATACATTGT-3’；反義鏈：5’-AGTCACAGCTGTATTGGTCG-3’。在EP管中分別加入各種反應(yīng)試劑：2 μL 10×PCR Buffer，1.6 μL dNTP Mix，上下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL，2 μL cDNA，14.5 μL H2O，輕輕震蕩使管中液體混合均勻，置于PCR儀內(nèi)，并根據(jù)相應(yīng)的反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.2.3 產(chǎn)物驗(yàn)證

取1.5 g瓊脂糖，加入1×TAE緩沖液150 mL，置于微波爐(Galanz)內(nèi)加熱至完全溶解，倒入裝有梳子的電泳模具中凝固，制備成1%瓊脂糖凝膠。然后，把凝膠放入電泳槽(Biorad)內(nèi)，加入1×TE電泳緩沖液，取5 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1 μL的6×Loading Buffer，與DNA marker一起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓，30 min電泳。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于EB染色液中染色10 min，之后在清水內(nèi)清洗10 min，最后利用生物電泳圖像分析系統(tǒng)(復(fù)日科技，F(xiàn)R-980A)觀察并拍照，確認(rèn)特異性目的條帶。

1.3.3 蛋白免疫印跡雜交

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用預(yù)冷的PBS清洗3遍后，在培養(yǎng)皿中加入適量PBS液，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞轉(zhuǎn)入EP管中。然后，200×g，離心半徑140 mm離心5 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀中加入適量細(xì)胞裂解液混合均勻，冰上放置10 min，使其充分裂解。接著12 000×g，4 ℃離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入新的EP管中，抽提的總蛋白用BCA法測(cè)定濃度，以2 000 μg/mL為標(biāo)準(zhǔn)，稀釋各個(gè)樣品，按照40 μg/孔上樣，即每孔的上樣量為20 μL的蛋白和5 μL的5×蛋白Loading Buffer。95 ℃加熱煮沸5 min，使蛋白變性，12 000×g離心1 min。制備12%分離膠(30%聚丙烯酰胺，pH=8.8 Tris-HCl、10%APS、10%SDS、TEMED)和濃縮膠(30%聚丙烯酰胺，pH=6.8 Tris-HCl、10%APS、10%SDS、TEMED)，放入蛋白電泳槽(Bio-rad)中，加入電泳緩沖液(25 mmol/L Tris，250 mmol/ L 甘氨酸，0.1%SDS)。上樣，接通電源，濃縮膠在80 V電壓條件下，分離膠在120 V電壓條件下進(jìn)行電泳，1.5 h后結(jié)束電泳。加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，并放入冰袋，整體置于冰盒內(nèi)，接通電源，在90 V電壓下轉(zhuǎn)膜2 h。隨后將PVDF膜浸于5%的牛奶中，封閉1 h。根據(jù)蛋白marker裁剪PVDF膜，加入用一抗稀釋液稀釋的抗體，4 ℃搖床溫育過(guò)夜。隔日，用TBST洗膜3次，每次10 min。室溫溫育二抗1 h，隨后用TBST洗膜3次，每次10 min。最后，化學(xué)發(fā)光法顯色。按照SuperSignal West Dura Extended Duration Substrated的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配制顯色液，加到PVDF膜上，用ImageQuant Las 4000 mini凝膠成像儀檢測(cè)特異性條帶。

1.3.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞分別以每孔3 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做5個(gè)平行樣本，將培養(yǎng)板在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。分別在0、1、2、3、4、5、6 d上述指定時(shí)間向每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度，計(jì)算每5孔的吸光度值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

細(xì)胞以每孔2×105密度接種于6孔培養(yǎng)板，將細(xì)胞在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24 h后，給予吉西他濱35 μmol/L處理48 h，胰酶消化收集細(xì)胞(培養(yǎng)基上清液一起收集)，200×g，離心半徑140 mm，離心5 min。然后細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗2遍。用1倍結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到1×106/mL。接著，加入5 μL AnnexinV-FITC及1 μL 100 μg/mL的PI工作液，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。最后，加入1倍結(jié)合緩沖液400 μL，輕輕混勻，用流式細(xì)胞檢測(cè)儀器(貝克曼)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。CXP 2.1軟件分析各個(gè)實(shí)相的細(xì)胞，至少50 000個(gè)細(xì)胞被檢測(cè)。

1.3.6 ELISA實(shí)驗(yàn)

分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0 pg/mL孔加試劑稀釋液)加入相應(yīng)孔中(100 μL/孔)用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃溫育90 min。提前準(zhǔn)備好抗體工作液，洗板5次，除空白孔外，加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃溫育60 min。提前制備酶結(jié)合物工作液，室溫避光放置。洗板5次，除空白孔外加入酶結(jié)合物液(100 μL/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃溫育30 min。洗板5次。加入顯色底物(包括空白孔)100 μL/孔，37 ℃避光溫育15 min。加入終止液100 μL/孔，混勻后即刻測(cè)量A450值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 耐藥細(xì)胞株231/Gem的鑒定及特性

將231和相應(yīng)的231/Gem細(xì)胞按2×105接種于6孔板，并在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，給予吉西他濱35 μmol/L處理，72 h后進(jìn)行凋亡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)231/Gem細(xì)胞的凋亡率明顯下降，比231細(xì)胞下降了28.8%，說(shuō)明231/Gem耐藥性穩(wěn)定(圖 1A)。利用CCK8進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與231細(xì)胞相比，231/Gem從第4天開(kāi)始增殖明顯加快即隨著時(shí)間的推移其增殖能力明顯增強(qiáng)(圖1B)。

2.2 耐藥細(xì)胞株231/Gem的增殖特性與XCL1的分泌增加相關(guān)

圖1 與231相比，231/Gem細(xì)胞凋亡減少(A)，隨時(shí)間變化增殖能力明顯增強(qiáng)(B)Fig. 1 Apoptosis of 231/Gem was reduced(A) the proliferation of 231/Gem signi fi cantly enhanced over time compare with 231(B)

本實(shí)驗(yàn)中，為研究趨化因子與吉西他濱耐藥的關(guān)系，從親本細(xì)胞231與建立的吉西他濱耐藥細(xì)胞株231/Gem提取RNA，對(duì)趨化因子家族C、CC、CXC、CX3C的代表性趨化因子進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與親本乳腺癌細(xì)胞相比，231/Gem細(xì)胞株中趨化因子X(jué)CL1 mRNA表達(dá)水平增高，而其他趨化因子未見(jiàn)分泌增加(圖2AB)。ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)乳腺癌耐藥細(xì)胞株中XCL1蛋白水平顯著增高(圖2C)。為了驗(yàn)證231/Gem的增殖能力與XCL1相關(guān)，我們?cè)谟H本231細(xì)胞株中加入外源性XCL1的重組蛋白，在231/Gem 細(xì)胞株中加入抗XCL1的抗體，24 h后發(fā)現(xiàn)培液中含XCL1細(xì)胞因子的231細(xì)胞株增殖能力增強(qiáng)(圖2D)。而加入抗XCL1抗體的耐藥細(xì)胞較231/Gem增殖速度減低(圖3A)。這些結(jié)果提示，耐藥細(xì)胞株增殖能力與XCL1的分泌增加相關(guān)。

2.3 mTOR信號(hào)通路的激活促進(jìn)XCL1的分泌

Western檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在耐藥細(xì)胞株中mTOR總蛋白表達(dá)水平、mTOR磷酸化水平以及下游蛋白P70S6K的磷酸化水平均比對(duì)照組顯著增強(qiáng)(圖3B)，提示耐藥細(xì)胞株中mTOR信號(hào)通路的激活可能與XCL1的分泌增加相關(guān)，為了驗(yàn)證這一設(shè)想，我們?cè)谀退幖?xì)胞株中加入mTOR的磷酸化抑制劑(100 nmol/L)——雷帕霉素(Rapamycin)，其能抑制mTOR的磷酸化，進(jìn)而抑制下游效應(yīng)分子70-KDaS6激酶(P70S6K)的活性，與我們猜測(cè)相同的是，耐藥細(xì)胞株中mTOR磷酸化水平以及下游蛋白P70S6K的磷酸化水平均被抑制(圖3C)ELASIA實(shí)驗(yàn)證實(shí)耐藥細(xì)胞XCL1分泌下降(圖3D)。這些結(jié)果提示mTOR信號(hào)通路的磷酸化促使XCL1的分泌增多，從而使耐藥細(xì)胞株的增殖能力增強(qiáng)。

圖2 與231相比，231/Gem中XCL1 mRNA表達(dá)(A，B)和蛋白質(zhì)水平(C)均升高，231中加重組XCL1可促細(xì)胞增殖(D)Fig. 2 Comparad to 231, mRNA expression(A, B) and protein level(C) of XCL1 in 231/Gem increased. Recombinant XCL1 promoted 231 proliferation (D)

圖3 231/Gem中加入抗XCL1抗體可拆抑制細(xì)胞增值(A)，231/Gem中mTOR及磷酸化P70S6K水平升高(B)，mTOR抑制劑rapamycin可逆轉(zhuǎn)之(C)，伴XCL1下調(diào)(D)Fig. 3 Anti-XCL1 reduced 231/Gem proliferation(A). mTOR and p-P70S6K were higher in 231/Gem(B), mTOR inhibitor rapamycin can invert them(C), and down-regulate XCL1(D)

3 討 論

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。近10年來(lái)，中國(guó)主要城市乳腺癌發(fā)病率增加了37%，全國(guó)則以3%～4%的水平呈逐年上升趨勢(shì)［7］。但是，乳腺癌治療中存在的耐藥問(wèn)題大大影響了化療藥物的臨床療效，是導(dǎo)致乳腺癌臨床治療失敗的主要原因之一。因此針對(duì)這些問(wèn)題，我們選用業(yè)已建立的耐吉西他濱的乳腺癌細(xì)胞株和親本細(xì)胞株作為研究對(duì)象，探討乳腺癌耐藥細(xì)胞株的增殖特性及其相關(guān)的機(jī)制。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與親本乳腺癌細(xì)胞株相比，乳腺癌耐吉西他濱細(xì)胞株的增殖能力明顯增強(qiáng)，這一現(xiàn)象與趨化因子X(jué)CL1的表達(dá)密不可分。趨化因子是能引起細(xì)胞定向遷移的細(xì)胞因子，對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)非常重要［8］。XCL1亦稱Lymphotactin(Ltn)是C族趨化因子家族的一員，其受體XCR1與XCL1相互作用參與抗原呈遞、激活T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，發(fā)揮機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡，增強(qiáng)黏膜免疫、抗腫瘤免疫，在感染性疾病過(guò)程中誘發(fā)炎性反應(yīng)等［8-10］。本次實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)XCL1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞尤其是耐藥細(xì)胞株的增殖，在乳腺癌耐藥細(xì)胞株中，我們檢測(cè)到XCL1的表達(dá)顯著增高，給予XCL1抗體后耐藥細(xì)胞株的增殖能力明顯下降，說(shuō)明耐藥細(xì)胞株中XCL1的上調(diào)導(dǎo)致其增殖能力增強(qiáng)。

TOR基因是 1991年在酵母中作為雷帕霉素的靶蛋白而被發(fā)現(xiàn)的，與酵母 TOR結(jié)構(gòu)和功能相應(yīng)的哺乳動(dòng)物的TOR稱為mTOR。mTOR被認(rèn)為是磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶蛋白質(zhì)家族成員［11］，它的主要功能是調(diào)控蛋白質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖［12］。mTOR激酶主要通過(guò)2種信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖：①PI3K/Akt /mTOR通路，Akt可直接磷酸化mTOR的Ser 2448位點(diǎn)，激活mTOR和下游途徑，控制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化所需的特殊蛋白質(zhì)的翻譯［13］。②Akt/TSC1-TSC2/mTOR/S6K通路，結(jié)節(jié)性腦硬化復(fù)合物(TSC)是腫瘤抑制因子，當(dāng)基因發(fā)生突變或缺失時(shí)引起細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)和遷移，可導(dǎo)致大腦及腎臟的結(jié)節(jié)性硬化性損壞。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，TSC1-TSC2復(fù)合物是mTOR的抑制因子，因此在TSC1-TSC2復(fù)合物異常的細(xì)胞中，mTOR及下游的效應(yīng)分子被激活，使細(xì)胞無(wú)限增殖［12-14］。mTOR的激活可以參與體內(nèi)多條信號(hào)通路，影響轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成。本實(shí)驗(yàn)中我們檢測(cè)到耐藥細(xì)胞株中mTOR及其活性形式p-mTOR表達(dá)增高，推測(cè)可能是mTOR信號(hào)通路的激活促使耐藥細(xì)胞株中分泌XCL1增多，從而促進(jìn)耐藥細(xì)胞株的增殖。在耐藥細(xì)胞株中加入mTOR抑制劑后，觀察到XCL1的表達(dá)顯著下降，進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的推測(cè)。

雖然目前對(duì)于腫瘤耐藥機(jī)制尤其細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的認(rèn)識(shí)有限，但有關(guān)研究已經(jīng)或正在為腫瘤治療帶來(lái)新的契機(jī)。借助腫瘤分子靶向治療，人們已經(jīng)開(kāi)始嘗試通過(guò)阻斷細(xì)胞中某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)、代謝以及腫瘤血管的生成［15-16］。本研究證實(shí)mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)產(chǎn)生XCL1可促進(jìn)乳腺癌耐藥細(xì)胞株的增殖，提示趨化因子參與腫瘤耐藥，這將為乳腺癌臨床治療提供新的吧點(diǎn)。

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XCL1 mediated by activation of mTOR pathway can promote the proliferation of drug-resistant breast cancer cell

BAI Yu-pan, YANG Xiao-li, OU Zhou-luo
(Breast Cancer Institute, Fudan University

Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

OU Zhou-luo E-mail: ouzhouluo@163.com

Background and purpose: More than 90% of cancer patients are incurable because of drug resistance. Activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in breast cancer, as a target for chemotherapy drugs has become a hot topic of breast cancer treatment. This study aimed to investigate the effect and mechanism of XCL1 on the proliferation of drug-resistant breast cancer cell, whether is related with the mTOR signaling pathway. Methods: Established gemcitabine-resistant breast cancer cell lines (MDA-MB-231/Gem). CCK8 to detect the proliferation of MDA-MB-231 and MDA-MB-231/Gem, RT-PCR and ELISA to determine the XCL1 expression level of the two cell lines, Western blot to detect the expression of mTOR. Results: Compared with MDA-MB-231, MDA-MB-231/Gem showed an enhanced proliferative capacity. The expression of XCL1 was increased in the resistant cell lines. Both of protein level and phosphorylation level of mTOR increased in drug-resistant cell lines. The MDA-MB-231 added exogenous XCL1 for 24 h, showed an enhanced cell proliferation. Adding anti-XCL1 antibodies in MDA-MB-231/ Gem could reduce cell proliferation and treating MDA-MB-231/Gem with the mTOR inhibitor could also reduce cell proliferation, as well as the XCL1 expression level. Conclusion: XCL1 promotes the proliferation of drug-resistant breast cancer cells mediated by activation of the mTOR pathway.

MDA-MB-231/Gem; C chemokine ligand 1; mTOR; Breast cancer

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.10.010

R737.9

A

1007-3639(2014)10-0770-07

2014-03-24

2014-05-08）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No:81172506)；上海市乳腺腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(No:12DZ2260100)。

歐周羅 E-mail:ouzhouluo@163.com