璟

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

放射耐受性結(jié)腸癌細(xì)胞亞株的建立及其生物學(xué)特性

馮景璟肖然 盧仁泉 郭林

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

背景與目的：結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)的常見(jiàn)腫瘤，放療是其重要的治療手段之一。誘導(dǎo)并篩選具有放射耐受性的結(jié)腸癌細(xì)胞亞株，為研究結(jié)腸癌放射耐受的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。方法：?yīng)用梯度遞增劑量的γ射線對(duì)SW620細(xì)胞株進(jìn)行誘導(dǎo)照射，篩選得到放射耐受細(xì)胞亞株SW620/R。觀察細(xì)胞的形態(tài)變化和生長(zhǎng)情況，通過(guò)CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞照射的周期及凋亡的變化，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成率和放射敏感性。結(jié)果：通過(guò)照射劑量梯度遞增的誘導(dǎo)方法，成功建立了SW620/R細(xì)胞亞株。SW620/R細(xì)胞亞株形態(tài)與親本細(xì)胞明顯不同，并且在高劑量射線照射后仍能繼續(xù)生長(zhǎng)；鑒定實(shí)驗(yàn)顯示SW620/R細(xì)胞亞株與親本細(xì)胞相比倍增時(shí)間明顯延長(zhǎng)，克隆形成率顯著下降；在細(xì)胞周期上S期的比例顯著上升，并且在照射后未出現(xiàn)周期的阻滯現(xiàn)象，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其自發(fā)凋亡率顯著下降；克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示其放射耐受性明顯升高。結(jié)論：成功建立了放射耐受的細(xì)胞亞株SW620/R，經(jīng)鑒定其放射敏感性顯著降低，且兩者在增殖、克隆形成率、細(xì)胞周期和自發(fā)凋亡上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

結(jié)腸腫瘤；放射耐受；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

結(jié)直腸癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2014年癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第3位［1］。其發(fā)病率在40歲開始上升，60～75歲時(shí)達(dá)到高峰，并且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。因此，其早期診斷、綜合治療和預(yù)后判斷一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。外科手術(shù)是治療結(jié)直腸癌的主要手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高。最近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)借助術(shù)前放療可提高根治性切除率，顯著降低局部復(fù)發(fā)率，可延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間［2］。本研究通過(guò)建立相關(guān)的放射耐受細(xì)胞亞株SW620/R，并且對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，不但可以為研究結(jié)腸癌放射耐受發(fā)生機(jī)制提供理想的細(xì)胞模型，而且還能為結(jié)腸癌個(gè)體化放射治療奠定基礎(chǔ)［3］。

1 材料和方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株購(gòu)自ATCC，異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，CCK8試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司，RPMI-1640、胎牛血清、胰蛋白酶及雙抗購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司，SARRP放療儀購(gòu)自美國(guó)Gulmay公司，劑量率為350 cGy/min.。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及放射誘導(dǎo)

培養(yǎng)親本SW620細(xì)胞株，待對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%，給予初次3 Gy劑量射線的照射，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%匯合度，胰酶消化傳代進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后(一般為3周)再次給予射線照射，同一劑量照射2次且每2次提高2 Gy照射劑量。

1.3 SW620/R與SW620細(xì)胞生長(zhǎng)性狀的比較

培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2組細(xì)胞SW620和SW620/R，觀察2組細(xì)胞在顯微鏡下形態(tài)學(xué)上的差異。分別給予2組細(xì)胞一定劑量的照射，每隔一定時(shí)間鏡下觀察它們?cè)谛螒B(tài)學(xué)上的差異。

1.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞克隆形成率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620和SW620/R細(xì)胞，每孔接種100個(gè)細(xì)胞于6孔板上，10～14 d后終止培養(yǎng)。固定、染色后，顯微鏡下計(jì)數(shù)有效克隆數(shù)(超過(guò)50個(gè)細(xì)胞數(shù)的克隆為有效克隆)并計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=克隆數(shù)/實(shí)際接種細(xì)胞數(shù)×100%，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5 CCK8法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620和SW620/R細(xì)胞，接種于96孔板上，每隔12 h加入10 μL CCK8作用3 h，于酶標(biāo)儀以450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值，根據(jù)Patterson公式計(jì)算細(xì)胞的群體倍增時(shí)間(population doubling time，PDT)：PDT=(t-t0)lg2/ lgN-lgN0。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定照射前、后細(xì)胞的周期和凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620和SW620/R細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%，給予9 Gy劑量射線的照射，在照射前和照射后24、72 h，分別消化離心收集2組細(xì)胞，用PBS洗滌。周期的測(cè)定：70%冷乙醇固定以及PI染色后，在流式細(xì)胞儀上分析并比較2組細(xì)胞照射前后的周期分布；自發(fā)凋亡率的測(cè)定：Annexin Ⅴ-FITC和PI染色后，在流式細(xì)胞儀上分析并比較2組細(xì)胞照射前后的自發(fā)凋亡率。

1.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞放射敏感性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620和SW620/R細(xì)胞，倍比稀釋后接種于6孔板上，根據(jù)細(xì)胞數(shù)目給予相應(yīng)的照射劑量，其后常規(guī)培養(yǎng)直至形成肉眼可見(jiàn)的克隆細(xì)胞。固定、染色后，顯微鏡下觀察克隆并計(jì)數(shù)。細(xì)胞的克隆形成率(plating efficiency，PE)和存活分?jǐn)?shù)(surviving fraction，SF)分別按以下公式計(jì)算：PE=每孔克隆數(shù)/每孔細(xì)胞接種數(shù)×100%；SF=實(shí)驗(yàn)組克隆形成率/對(duì)照組克隆形成率×100%。采用多靶單擊模型曲線［SF＝1-(1-e-Do/D)N］擬合2組細(xì)胞的劑量存活曲線，并求出相關(guān)的放射生物學(xué)參數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，細(xì)胞生長(zhǎng)及存活曲線用Sigmaplot 10.0統(tǒng)計(jì)軟件擬合，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 放射耐受SW620/R細(xì)胞亞株的建立

放射耐受SW620/R細(xì)胞亞株通過(guò)梯度遞增照射劑量的誘導(dǎo)方法建立，分別在3、5、7和9 Gy劑量下各照射了2次，累計(jì)照射48 Gy的劑量。細(xì)胞株建立后繼續(xù)傳代培養(yǎng)4周，進(jìn)行相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)。

2.2 SW620/R細(xì)胞亞株的形態(tài)學(xué)改變

觀察發(fā)現(xiàn)，SW620細(xì)胞株其細(xì)胞外形呈扁平梭形，細(xì)胞核圓形，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞彼此間緊密相連；而SW620/R細(xì)胞亞株的形態(tài)學(xué)改變明顯，部分細(xì)胞呈不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞膜邊界不清，細(xì)胞內(nèi)的顆粒和空泡增多，偶見(jiàn)一些多核細(xì)胞(圖1)。

2.3 照射后SW620/R細(xì)胞亞株與親本細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

在9 Gy劑量的射線照射下，親本細(xì)胞SW620幾乎完全死亡，而SW620/R則能存活下來(lái)。照射2周后鏡下幾乎找不到貼壁的SW620細(xì)胞，而SW620/R僅出現(xiàn)了一定程度的凋亡和生長(zhǎng)抑制，3周后鏡下僅能觀察到SW620的細(xì)胞碎片，而SW620/R則形成大量克隆分布在培養(yǎng)瓶中且已恢復(fù)生長(zhǎng)狀態(tài)(圖2)。因此，可見(jiàn)相比親本細(xì)胞SW620/R對(duì)射線的敏感性明顯降低。

2.4 細(xì)胞克隆形成率的差異

SW620和SW620/R的克隆形成率分別為(73.33±4.16)%和(31.33±5.86)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.51，P＜0.05)，表明親本細(xì)胞的克隆形成能力明顯高于放射耐受細(xì)胞(圖3)。

圖1 SW620/R建立前、后的形態(tài)改變Fig. 1 Morphological changes of SW620/R before and after establishment

圖2 SW620/R和SW620照射后的生長(zhǎng)情況Fig. 2 Growth of SW620/R and SW620 after illumination

2.5 細(xì)胞增殖能力比較

根據(jù)Patterson公式計(jì)算得到SW620和SW620/ R的PDT分別為(28.08±0.82)h和(39.37±1.78)h，延長(zhǎng)約11.29 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.78，P＜0.05，圖4)。說(shuō)明親本細(xì)胞SW620在增殖速度上明顯快于放射耐受細(xì)胞株。

圖3 SW620和SW620/R細(xì)胞染色后的鏡下克隆Fig. 3 Microscopic colony of SW620 and SW620/R after coloring

2.6 照射前、后SW620與SW620/R細(xì)胞的周期分布

圖4 SW620和SW620/R細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig. 4 Cell growth curve of SW620 and SW620/R

經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與照射前SW620相比，SW620/R細(xì)胞G0/G1期比例不變，S期比例增加，G2/M期比例減少(χ2=12.00，P＜0.05)。照射72 h后收集的2組細(xì)胞檢測(cè)周期可見(jiàn)，親本細(xì)胞周期在G0/G1期出現(xiàn)了明顯的周期阻滯，而SW620/R未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象(圖5)。

圖5 SW620和SW620/R照射前、后細(xì)胞周期分布Fig. 5 Cell cycle distribution of SW620 and SW620/R before and after illumination

2.7 照射前、后SW620與SW620/R細(xì)胞的凋亡情況比較

經(jīng)統(tǒng)計(jì)比較發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下SW620與SW620/R的凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7.3% vs 2.4%，P＞0.05)，而照射9 Gy劑量射線72 h后檢測(cè)結(jié)果顯示SW620的凋亡率明顯高于SW620/ R(24.8% vs 8.3%)，可見(jiàn)照射一定劑量射線后，親本細(xì)胞的凋亡率顯著升高，放射耐受能力明顯不如耐受細(xì)胞株(圖6)。

2.8 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞放射敏感性

經(jīng)不同劑量的射線照射后，計(jì)算2組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，觀察發(fā)現(xiàn)照射劑量達(dá)到7 Gy時(shí)，與親本細(xì)胞相比，SW620/R的放射敏感性顯著降低(t=22.44，P＜0.01)，2組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)采用單擊多靶模型進(jìn)行擬合，劑量-效應(yīng)擬合曲線見(jiàn)圖7。SW620細(xì)胞擬合公式：SF=1-(1- e-D/1.06)18.15(R2=0.999 2，P＜0.05)；D0=1.06；N=18.15；Dq=1.33；SW620/R細(xì)胞擬合公式：SF=1-(1-e-D/1.19)22.62(R2=0.999，P＜0.05)；D0=1.19；N=22.62；Dq=1.61。

圖6 照射前、后SW620和SW620/R細(xì)胞的自發(fā)凋亡率Fig. 6 Spontaneous apoptosis of SW620 and SW620/R before and after illumination

圖7 SW620和SW620/R細(xì)胞存活曲線Fig. 7 Cell survival curve of SW620 and SW620/R

3 討 論

放療與手術(shù)切除的聯(lián)合治療在結(jié)直腸癌的治療中越來(lái)越受到重視，由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在放射敏感性的差異，往往在同一放射治療條件下會(huì)產(chǎn)生不同的治療效果［4］。如果能夠闡明放射耐受形成的機(jī)制及放射耐受形成與照射劑量的關(guān)系，就能設(shè)計(jì)出相應(yīng)的解決方案，提高腫瘤治療的療效［5］。國(guó)內(nèi)、外已經(jīng)建立了多株放射耐受對(duì)比細(xì)胞模型［6-7］，并對(duì)其放射耐受機(jī)制做了初步的研究。本研究通過(guò)梯度遞增照射劑量的誘導(dǎo)方法成功建立了具有穩(wěn)定放射耐受能力的細(xì)胞亞株SW620/R，從而為進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌放射耐受機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

已建立的放射耐受細(xì)胞亞株SW620/R進(jìn)行傳代培養(yǎng)［8］，經(jīng)歷時(shí)間約為4周，此時(shí)生物學(xué)性狀基本穩(wěn)定。本研究結(jié)果顯示，SW620/R與其親本細(xì)胞SW620無(wú)論在細(xì)胞形態(tài)上，還是克隆形成能力以及細(xì)胞倍增時(shí)間上都存在顯著差異。通常情況下，增殖速度較快的細(xì)胞株具有更高的放射敏感性，反之，增殖速度較慢的細(xì)胞群體對(duì)射線相對(duì)不敏感［9］，這與實(shí)驗(yàn)所得到的SW620在克隆形成和增殖能力方面明顯強(qiáng)于SW620/R的結(jié)論是一致的。

本研究采用多靶單擊模型進(jìn)行細(xì)胞放射敏感性的分析［10］，從擬合2組細(xì)胞的生存曲線得到的放射學(xué)參數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，相比其親本細(xì)胞，SW620/R的放射敏感性顯著降低，這與2組細(xì)胞在相同劑量射線照射后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況所得的結(jié)果(親本細(xì)胞幾乎完全死亡，放射耐受細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng))也是一致的，從而進(jìn)一步說(shuō)明了所構(gòu)建的細(xì)胞株是具有一定放射抗拒性的［11］，并且該抗拒性能夠穩(wěn)定傳代。

已有研究表明，G2/M期細(xì)胞對(duì)射線最敏感，G1期細(xì)胞次之，S期細(xì)胞對(duì)射線最抗拒，如果不敏感期的細(xì)胞比例增加，那么細(xì)胞在射線照射時(shí)更有可能表現(xiàn)出抗拒性。本研究檢測(cè)2組細(xì)胞的周期后可以發(fā)現(xiàn)，在射線照射前，與親本細(xì)胞相比放射耐受細(xì)胞SW620/R的S期細(xì)胞比例明顯增加，而G2/M期細(xì)胞比例明顯減少，這與細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得到的結(jié)果(親本細(xì)胞的自發(fā)凋亡率顯著高于耐受細(xì)胞)是一致的。因此，可以大膽推測(cè)放射耐受細(xì)胞株細(xì)胞S期細(xì)胞比例增加可能是其增強(qiáng)自身放射抗拒能力的一種途徑之一［12］。此外，G1期阻滯是p53表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞輻射后細(xì)胞周期的主要反應(yīng)，在本研究中，在射線照射后，p53表達(dá)陽(yáng)性的親本細(xì)胞SW620出現(xiàn)了明顯的G1期阻滯現(xiàn)象，而放射耐受細(xì)胞SW620/R則未出現(xiàn)明顯的周期阻滯，這可能是兩者在p53的表達(dá)上有差異而引起的，因此，推測(cè)p53的表達(dá)可能與SW620/R的放射耐受機(jī)制相關(guān)，可以對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究通過(guò)梯度遞增照射劑量的誘導(dǎo)方法成功構(gòu)建了一株放射耐受細(xì)胞亞株SW620/R，該細(xì)胞亞株傳代4周后所進(jìn)行的相關(guān)研究表明該細(xì)胞的放射抗拒能力是可以穩(wěn)定傳代的，并且推測(cè)該細(xì)胞S期細(xì)胞比例的增加可能是其產(chǎn)生放射抗拒能力的誘因之一，但是詳細(xì)的放射耐受產(chǎn)生機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

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Establishment of radioresistant colorectal cancer cell-subline and its biological characteristics

FENG Jing-jing, XIAO Ran, LU Ren-quan, GUO Lin
(Department of Clinical Laboratory, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

GUO Lin E-mail: guolin500@hotmail.com

Background and purpose: Colorectal cancer is a common tumor of digestive system, radiation therapy is one of the important means of treatment. To explore the mechanism of colorectal cancer cell tolerated to radiation, radioresistant colorectal cancer cell-subline was induced and screened. Methods: Colorectal cancer SW620 cells were repeatedly given individual doses of γ-rays to induce radiation resistance. After monoclonal cells being selected and extensively cultured, the cell subline was named SW620/R. Morphological changes and growth of the cells before and after illumination were observed. Cell proliferation was tested by CCK8 assay. The distribution of cells in different stages of the cell cycle and apoptosis were investigated by fl ow cytometry. The relative radiosensitivities of tumor cells were assessed by standard colony formation assays. Results: SW620/R cells were established by gradient of increasing radiation dose induction method. SW620/R showed signi fi cant morphological changes compared with the parent strain SW620. Proliferation experiments showed SW620/R cell line doubling time was longer than SW620, clonogenic capacity decreased signi fi cantly. The resistant cells showed a higher percentage of cells in S phase and didn't appear cell cycle retardation, and the apoptosis rates were also found large differences between two cell lines after irradiation. SW620/R showed lower radiosensitivity by colony-forming assay. Conclusion: Radioresistant colorectal cancer cell subline SW620/R was established and it has lower radiosensitivity than the parental cell line. Two cell lines also have signi fi cant differences in proliferation, the rate of colony formation, cell cycle and spontaneous apoptosis (P＜0.05).

Colorectal cancer; Radiation resistance; Cell cycle; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.12.002

R735.3+5

A

1007-3639(2014)12-0889-06

2014-08-06

2014-09-08）

郭林 E-mail:guolin500@hotmail.com