王長遠(yuǎn) 許 鳳 張 敏

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319）

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院2，哈爾濱 150030）

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院3，北京 100037）

蛋白質(zhì)的改性方法有物理法、化學(xué)法、生物法和基因工程法[1]。物理改性是利用熱、電、磁、機(jī)械能等物理作用形式改善蛋白的功能特性，對產(chǎn)品無毒副作用及對產(chǎn)品營養(yǎng)性能影響較小。超聲波被認(rèn)為是安全、無毒、環(huán)保的，這是超聲相比于其他改性技術(shù)的一大優(yōu)勢。超聲可分為2大類：低強(qiáng)度超聲（頻率100 kHz～1 MHz，功率 ＜1 W／cm2）和高強(qiáng)度超聲（頻率16～100 kHz，功率 10～1 000 W／cm2），低強(qiáng)度超聲是一種常用的分析技術(shù)，可以為食物物理化學(xué)性質(zhì)（如硬度、糖度、酸度等）提供數(shù)據(jù)，而高強(qiáng)度超聲可用于改變食物的物理化學(xué)性質(zhì)[2]。

目前，應(yīng)用高強(qiáng)度超聲改變生物大分子被廣泛的研究，如使用超聲水解淀粉，形成短鏈分子和還原糖[3]。Chen等[4]利用超聲波處理來增加蛋白質(zhì)的水解速率。楊會麗等[5]對大豆分離蛋白進(jìn)行超聲處理的研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理后蛋白的溶解性、起泡性和乳化性顯著提高。也有報(bào)道指出乳清蛋白和酪蛋白經(jīng)20 kHz的超聲處理后，降低了蛋白的黏度，并且改善了凝膠特性[6]。除了研究超聲對蛋白功能性質(zhì)的影響外，也有學(xué)者對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測定。Kre?ic＇a等[7]報(bào)道，超聲處理雖然沒有改變?nèi)榍宓鞍椎膸€基含量，但輕微的改變了其二級結(jié)構(gòu)和表面疏水性。Krishnamurthy等[8]利用PAGE和體積排阻色譜法研究超聲處理對溶菌酶亞基組成變化情況，發(fā)現(xiàn)蛋白片段之間無差異，認(rèn)為超聲作用并沒有引起一級結(jié)構(gòu)的變化。

已有研究證明超聲能夠顯著改善蛋白的功能特性，并且超聲波技術(shù)具有作用時間短、操作簡單易控制及能耗較低等優(yōu)點(diǎn)[9]，然而關(guān)于用超聲處理RBP改善其功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的研究還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)研究了超聲處理時間對RBP溶解性、起泡性、乳化性、表面疏水性、游離巰基和亞基組成的影響，為RBP的深加工提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

牛血清白蛋白、TEMED、β-巰基乙醇、丙烯酰胺、N，N-甲叉雙丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R-250、DTNB、ANS：美國 Sigma公司；低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白：中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所。

1.2 材料與儀器

全脂米糠：黑龍江省農(nóng)墾總局查哈陽農(nóng)場，水稻品種為空育131。

FS-450N超聲波處理器：上海生析儀器有限公司；TDZ5-WS臺式低速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RF-5301熒光分光光度計(jì)：島津國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 RBP的制備

原料米糠過60目篩，按照1∶10（g∶mL）加入正己烷，室溫下于通風(fēng)櫥中不斷攪拌脫脂4 h，4 000 r／min，離心10 min，脫脂后將米糠置于通風(fēng)櫥中揮發(fā)至干。

根據(jù)王威等[10]的方法提取RBP。脫脂米糠50 g，加入500 mL蒸餾水，用NaOH溶液調(diào)pH至9，室溫下攪拌2 h，4 000 r／min離心20 min，上清液調(diào)節(jié)pH至4.5，4 000 r／min離心15min，沉淀于4℃對蒸餾水透析48 h，真空冷凍干燥，干粉于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定

凱氏定氮法（GB 5009.5—2010）。

1.3.3 RBP的超聲處理

分別稱取200 mg米糠濃縮蛋白于燒杯中，加入20 mL pH 7.4的磷酸緩沖溶液，混合液置于冰水浴中溫度平衡后，使用20 kHz，額定功率450 W的超聲破碎儀，在工作時間為4 s，間歇時間2 s，振幅為50%的條件下，超聲處理累計(jì)時間分別為5、15、30、45 min。

1.3.4 溶解性的測定

將200 mg樣品溶解在20 mL的0.01 mol／L pH 7.4的磷酸緩沖液中，室溫下攪拌30 min，4 000 r／min離心20 min，用福林酚法測定上清液中蛋白質(zhì)含量，所有試驗(yàn)重復(fù)測定3次，蛋白質(zhì)的溶解度按下式計(jì)算。

蛋白質(zhì)的溶解度＝（上清液中蛋白質(zhì)的含量／樣品中蛋白質(zhì)含量）×100%

1.3.5 乳化性的測定

將經(jīng)超聲處理的各樣品濃度稀釋至1 mg／mL，取3 mL樣品加入2 mL大豆油，高速均質(zhì)后于500 nm處測定吸光值，以0.1%的 SDS（十二烷基磺酸鈉）溶液作為空白，室溫放置10 min后再次取樣測定[11]。按下式計(jì)算：

乳化活性（EAI）／m2／g＝（2×2.303×A0×N）／（c×Φ×104）

乳化穩(wěn)定性（ESI）／min＝（A0×t）／（A0-A30）

式中：A0為均質(zhì)后迅速被稀釋的乳化液的吸光值；A30為乳化液在靜止30 min后的吸光值；t為時間（本試驗(yàn)30 min）；N為稀釋倍數(shù)；Φ為乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)（本試驗(yàn)是0.4）；c為樣品溶液中蛋白質(zhì)濃度／g／mL。

1.3.6 起泡性的測定

根據(jù)Sze-Tao等[12]描述的方法測定起泡性（FC）和泡沫穩(wěn)定性（FS）。將經(jīng)超聲處理的各蛋白樣品稀釋至 1 mg／mL，13 000 r／min速度下均質(zhì) 2 min。迅速將混合液轉(zhuǎn)移至25 mL的量筒中，量取攪拌前和攪拌后的體積，攪拌后增加的體積（%）即為FC，F(xiàn)S為泡沫在30 min內(nèi)的變化。FC和FS按以下公式計(jì)算：

式中：V為未經(jīng)攪拌的樣品溶液的體積／mL；V0為攪拌結(jié)束時刻泡沫體積／mL；V30為攪拌結(jié)束30 min時泡沫體積／mL。

1.3.7 游離巰基的測定

根據(jù) Lagrain等[13]和 Shiyi等[14]描述的方法測定游離巰基含量。取1.0 mg／mL蛋白溶液1.0 mL加入2.0mL Tris-甘氨酸緩沖溶液和20μL 4 mg／mL DTNB的Ellman試劑，室溫下放置5 min，用分光光度計(jì)在412 nm波長下測定吸光度值，以不加樣品而加Ellman試劑為空白，以不加Ellman試劑而加樣品溶液測其混濁度。巰基含量計(jì)算如下：

式中：A412為加DTNB時樣品的吸光度-不加DTNB時樣品的吸光度；D為樣品的稀釋倍數(shù)；C為固形物含量。

1.3.8 表面疏水性的測定

根據(jù)Gulseren等[15]描述的方法測定。采用ANS熒光探針法。熒光條件：激發(fā)波長390 nm；發(fā)射波長470 nm（400～600 nm掃描獲得）；狹縫寬度5 nm。

1.3.9 SDS-PAGE凝膠電泳

根據(jù)Zhao等[16]描述的方法進(jìn)行，濃縮膠為5%，分離膠濃度為12%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為±s。用SAS 8.12進(jìn)行顯著性及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量的測定

采用凱氏定氮法測定提取的米糠蛋白干粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（74.43±1.38）%。

2.2 超聲處理后樣品溫度和pH的變化

表1所示，超聲處理后的樣品溶液的pH值沒有顯著的變化（P＞0.05）。樣品的起始溫度為室溫下溶液的溫度為23℃，處理后溶液的溫度升高到30℃左右，顯著低于Abayomi等[17]報(bào)道的RBP的變性溫度。這是符合邏輯的，因?yàn)?0 kHz探頭工作時會有較高的能量輸入，過多的能量被釋放出來導(dǎo)致溫度上升。

表1 超聲時間對蛋白溶液的pH和溫度的影響

2.3 溶解性分析

如圖1所示，在超聲時間5～45 min，溶解度的增幅不大，與未經(jīng)超聲處理的RBP相比，超聲處理后的RBP的溶解度顯著增加，由25.52%增加到79.23%～83.88%。溶解度增加是因?yàn)槌曁幚磉^程中產(chǎn)生大量的空化氣泡，氣泡崩潰時其周圍區(qū)域的溫度和壓力大幅增加，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子展開和部分基團(tuán)暴露。Morel等[18]指出高強(qiáng)度超聲（20 kHz探頭）通過改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)使親水性的氨基酸暴露，靜電引力增加，更多的水分子與蛋白質(zhì)作用，從而增加了蛋白質(zhì)的溶解性。

圖1 超聲時間對RBP溶解性的影響

2.4 乳化性分析

由試驗(yàn)結(jié)果（見圖2）可知，隨著超聲時間的延長，RBP的乳化活性和乳化穩(wěn)定性顯著增加，在30～45 min時，EAI和ESI最強(qiáng)。與未經(jīng)超聲處理的RBP相比，EAI增加了82.28%左右。這是因?yàn)槌曁幚砗蟮鞍椎氖杷鶊F(tuán)外露，結(jié)構(gòu)變得更加無序，并且減小了液滴的尺寸，使蛋白更多的吸附在油-水界面。孫冰玉等[19]在對大豆蛋白超聲處理（如均質(zhì)）過程中指出，震蕩運(yùn)動有利于蛋白質(zhì)的吸附和形成可溶性聚集體。所以超聲處理后的蛋白的乳化活性得到了改善。在超聲過程中湍流運(yùn)動的影響下，使乳化液中的油泡一體化，蛋白質(zhì)具有更好的取向，這可以解釋乳化穩(wěn)定性的增加。

圖2 超聲時間對RBP乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

2.5 起泡性分析

機(jī)械均質(zhì)過程往往會增加起泡能力，超聲的均質(zhì)作用通常是使蛋白質(zhì)顆粒分布更均勻[20]。經(jīng)超聲處理的RBP起泡性和泡沫穩(wěn)定性得到了改善（見圖3）。隨著超聲時間的增加，F(xiàn)C和FS先增大后減小。FC由52.7%最大增加到82.5%，F(xiàn)S由71.37%增加到73.57%。試驗(yàn)結(jié)果表明，為使蛋白具有較好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，超聲時間應(yīng)控制在15 min左右。

圖3 超聲時間對RBP起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

2.6 表面疏水性分析

蛋白質(zhì)的表面疏水性是極性水環(huán)境中蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)數(shù)目的指標(biāo)，并且與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)密切相關(guān)。不同超聲處理?xiàng)l件下的RBP表面疏水性如表2所示，在0～30 min，表面疏水性逐漸增大，在30 min時達(dá)到最大，比對照組提高了15.6%。而隨著超聲時間的進(jìn)一步延長，表面疏水性略有下降。這一結(jié)果與Gülseren等[15]研究的超聲處理能夠增加BSA表面疏水性的結(jié)論一致。在這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，表面疏水與溶解性呈正相關(guān)，而王中江等[21]研究表明大豆蛋白的溶解性與疏水性呈負(fù)相關(guān)。出現(xiàn)這種矛盾的結(jié)果可能是因?yàn)楸┞对诘鞍追肿颖砻娴氖杷鶊F(tuán)廣泛的參與分子間的作用，降低了蛋白的溶解性。相反的，超聲處理后隨著蛋白表面疏水性的增加，降低了與分子間的相互作用，并且蛋白粒徑減小，故溶解度升高。

表2 超聲時間對RBP表面疏水性及游離巰基含量的影響

2.7 游離巰基含量分析

采用Ellman試劑法對不同超聲處理時間的RBP游離巰基含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。未處理的RBP游離巰基含量為（3.68±0.04）μmoL／g，隨著超聲時間的延長RBP游離巰基含量先增加后減小。在超聲5 min時，游離巰基含量增加了16%，是因?yàn)槌曁幚硎沟鞍追肿诱归_，更多的巰基暴露于RBP分子表面。Jambrak等[22]報(bào)道，超聲過程中產(chǎn)生的瞬間高壓、液體的湍流運(yùn)動和空化作用剪切力減小了SPI的粒徑，在此過程中使埋藏的巰基暴露出來。隨著超聲時間的進(jìn)一步延長，RBP游離巰基含量下降，在30和45 min時的游離巰基含量與未處理蛋白的巰基含量未見顯著差異（P＜0.05）。巰基含量下降可能是因?yàn)槌暱栈饔卯a(chǎn)生的過氧化氫與巰基反應(yīng)（被氧化），并且蛋白局部變性或巰基的增加是短暫的并且是可逆的，這已在牛血清蛋白中被證實(shí)[23]。

2.8 亞基組成分析

由于先前的結(jié)果顯示，超聲處理后的RBP的溶解性和表面疏水性增加可能是因?yàn)樾纬闪丝扇苄缘牡鞍拙奂w或蛋白裂解，所以通過還原（樣品緩沖液中含巰基乙醇，圖4b）和非還原（未加巰基乙醇，圖4a）SDS-PAGE判斷亞基間是否有二硫鍵，進(jìn)而評價(jià)不同超聲處理時間對RBP分子組成的影響。在非還原狀態(tài)下，RBP主要亞基的分子質(zhì)量為53、36、24、21 u（圖4a）；還原條件下，RBP主要亞基的分子質(zhì)量為63、53、49、36、＜21 u（圖4b）。由圖4可知，不同超聲時間處理的RBP與未處理的RBP的還原和非還原電泳圖譜基本一致，表明不同超聲處理時間對RBP的亞基組成無影響。這與Karki等[24]對大豆分離蛋白的研究結(jié)果一致。由圖4a與圖4b對比知，在巰基乙醇存在下，RBP大分子聚集體斷裂成小分子聚集物和α、α′，并且β′亞基的含量也有增加，但大聚集體仍有部分不能降解。表明構(gòu)成RBP大聚集體和小分子質(zhì)量亞基相互作用力以二硫鍵為主。

圖4 超聲時間的RBP的SDS-PAGE電泳

3 結(jié)論

與傳統(tǒng)方法相比，超聲具有低能耗、短時、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)。高強(qiáng)度超聲處理的RBP的功能性質(zhì)如溶解性、乳化性和起泡性有明顯的改善，這與分子的變化密切相關(guān)，主要表現(xiàn)在表面疏水性的增加和粒徑的減小，并且通過紫外和熒光光譜的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度超聲處理改變了RBP的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響了其功能性質(zhì)。但這種處理并沒有改變蛋白的亞基組成，但對二級結(jié)構(gòu)的影響還有待于進(jìn)一步的研究。

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